逆转录与RT-PCR课件.ppt

逆转录与RT-PCRReverse transcription RT-PCR 一、逆转录和逆转录酶的发现 实验现象： 1、1964年，Temin等首次发现：DNA合成抑制剂可以遏制鸟类肉瘤病毒ASV等RNA肿瘤病毒所造成的感染 表明在RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中需要合成 DNA。 2、ASV子代病毒颗粒的产生被放线菌素D所抑制 说明转录对于RNA肿瘤病毒增殖可能是必须的。 假想： DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌过程中的中间物 这一过程大致为：RNA肿瘤病毒－DNA原病毒（或前病毒）－RNA肿瘤病毒。 证明： 1970年，Temin和Baltimore分别在RNA肿瘤病毒中发现了逆转录酶 (reverse transcriptase )。 Howard Temin and David Baltimore于1975年荣获诺贝尔生理与医学奖。 二、逆转录病毒（retrovirus） 1. 定义：含逆转录酶的RNA病毒称为逆转录病毒。 所有的RNA肿瘤病毒都是逆转录病毒，但是，并不是所有的逆转录病毒都致癌。 2. 逆转录病毒的基因组： 逆转录病毒基因组由两条相同的正链RNA分子组成，每个约8,500nt，其5‘端有cap，3’端有ployA尾。 三、逆转录酶（reverse transcriptase） 定义： 是RNA指导的DNA聚合酶。 具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶、DNA指导的DNA聚合酶和RNase H的活性。 合成DNA的方向： 逆转录酶合成DNA的方向为5’－3’。 合成DNA的引物： 不能从头合成DNA。引物为逆转录病毒包装时从宿主细胞获得的tRNA分子。 一些鸟类逆转录病毒以宿主tRNATrp为引物，而鼠类逆转录病毒则以宿主细胞tRNAPro为引物。 RNase H活性：是指逆转录酶可以从5’－3’和3’－5’两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的RNA。 四、逆转录 1. 逆转录（reverse transcription）： 是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。 2. 逆转录病毒基因组复制过程 在逆转录过程中，新合成的DNA链要发生两次“跳跃”（jump），以改变链间碱基配对的位置，使双链DNA的两端产生相同的长末端重复序列LTR (long terminal repeats)。 LTR中含有整合信号、转录信号（启动子）、增强子和poly A位点等序列，通常只有左侧LTR中的启动子和右侧LTR中的polyA位点发挥正常功能，这是由它们所在的位置所决定的。 逆转录原理的应用－RT-PCR 反转录PCR（Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction ， RT-PCR）： 是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链扩增（PCR）相结合的技术。 RT-PCR过程 首先经反转录将RNA逆转录成cDNA 然后以cDNA为模板，PCR扩增合成目的片段。 模板RNA： 总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。 无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择：随机引物（random hexamer）、Oligo dT 及基因特异性（gene-specific）引物中的一种。 对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。 Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。 基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。 注意事项 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。 2. 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 3. 内参的设定：主要是为了用于靶RNA定量。常用的内参有Tublin、β-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一等所造成的误差。 4. PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。