第七章++基因治疗.pptVIP

7.1 基因治疗的概念与发展 7.1.1 基因治疗的概念与策略 7.1.2 基因治疗的基本程序 7.1.3 基因治疗的现状与展望 7.2 基因治疗的载体 7.2.1 病毒载体 7.2.2 非病毒载体 7.2.3 载体与基因治疗中的靶向性问题 7.3 重要疾病的基因治疗 7.3.1 遗传病的基因治疗 7.3.2 肿瘤的基因治疗 7.3.3 病毒病的基因治疗 第一节 基因治疗的概念与发展 基因治疗的概念与策略 基因治疗的基本程序 基因治疗的现状与展望 一、 基因治疗的概念 基因治疗（gene therapy）——就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。 基因治疗的前提条件 发病机制在DNA水平上已经清楚 要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解 该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作 基因治疗的策略 1）基因置换，就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。 2）基因修复，是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。 3）基因修饰，又称基因增补。是将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得到加强。 4）基因失活，利用反义RNA、核酶或肽核酸等反义技术及RNA干涉等技术能特异地封闭基因表达的特性，抑制一些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的。 5）免疫调节，这是将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人的免疫状态，从而达到预防和治疗疾病的目的。 基因治疗的两种途径 1）ex vivo法，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体内，让外源基因表达以改善患者症状。 2）in vivo法，直接将外源DAN注射到机体内，使其在体内表达发挥治疗作用。 in vivo法比ex vivo法更简单、直接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移手段有病毒介导，脂质体介导和基因直接注射等。 二、基因治疗的基本程序 基因治疗的主要步骤 ①目的基因的克隆 ②基因转移系统的建立 ③靶细胞的选择 ④基因的导入。 1. 目的基因的选择和制备 用于基因治疗的基因必须满足以下条件： 1）在体内仅有少量表达就可以显著改善症状； 2）该基因的过高表达不会对机体造成危害； 3）外源基因可有效导入靶细胞 4）外源基因能在靶细胞中长期稳定存留 5）导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害 2. 靶细胞的选择 1）生殖细胞 基因的转移只能用显微注射，效率不高，并且只适用于排卵周期短而次数多的动物，不适用于人类。所以，这种靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展。 2）体细胞 采取基因置换、基因修复等方式，但还不能实现特定位点的基因转移。只能采取基因在基因组上非特定定位，随机整合的方式。只要基因能表达产物就可以达到治疗的目的。是一种异常基因功能补偿的基因治疗方式。 靶细胞的选择 最好为组织特异性细胞 细胞较易获得，且生命周期较长 离体细胞较易受外源基因转化 离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活 常用的靶细胞 造血细胞 皮肤成纤维细胞 肝细胞 血管内皮细胞 淋巴细胞 肌肉细胞 肿瘤细胞 3.转移载体的选择与细胞转染 病毒感染、显微注射、电穿孔、化学转染试剂等。 4.外源基因的表达及检测 第二节 基因治疗的载体 病毒载体 非病毒载体 载体与基因治疗中的靶向性问题 一 、病毒载体 逆转录病毒载体 腺病毒载体(AV) 腺伴随病毒载体（AAV） 逆转录病毒载体 retrovirus 2. 腺病毒载体(AV) 腺病毒的结构 蛋白质外壳 包囊外壳蛋白：由纤维状蛋白分子和角蛋白组成 骨架蛋白：起着保持包囊形状的作用 DNA结合蛋白：与DNA结合 线性双链双螺旋病毒DNA 腺病毒基因组DNA 基因组长36kb，两端各有一个ITR，ITR内侧为病毒包装信号。 6个早期转录基因：E1a, E1b，E2a, E2b，E3, E4，承担基因调控功能 1个晚期转录单元(5个晚期基因L1-L5)：负责结构蛋白的编码。 E1的缺失可能造成病毒再复制阶段的流产，E3为复制非必须区，可被外源基因替代。 腺病毒载体的构建 第一代腺病毒载体缺少E1a和 E1b基因，取代的是治疗基因。包装细胞基因组含有E1基因；但第一代腺病毒载体产生炎症，而且基因表达快速衰退； 第二代腺病毒载体在删除E1的基础上，或者突变E2区或直接除掉E2或E4区，基因型为E1－\E2－或E1－\E4－。由于保留有E3区，可抑制宿主的免疫反应。 第三代腺病毒载体正在开发，目的是尽可能多删除全部的反式序列基因，以降低病