医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测.pptVIP

医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测 安徽省细菌耐药监控中心 安徽医科大学临床检验诊断学教研室 安徽医科大学第一附属医院检验科 徐元宏 一、医院感染 1、定义 医院感染(nosocomial infection)是指患者在入院时既不存在，亦不处于潜伏期，而在医院内发生的感染，包括医院内获得而在出院后发病的感染。随着医疗技术发展，各种侵入性操作和器官移植推广，化疗、糖皮质激素、抗生素等广泛应用，医院感染是当今医学领域中的重要问题。 2、病原学 细菌为最常见的病原体，细菌的种类与分布因感染类型、医院类别、患者基础疾病和治疗措施不同各异。目前，以革兰阴性杆菌为主(如肠杆菌科和非发酵菌)，近十余年来抗生素大量应用，常见耐甲氧西林葡萄球菌医院感染，留置导尿、人工心脏瓣膜等的医院感染中凝固酶阴性葡萄球菌感染率上升，手术切口和尿路肠球菌感染也不少见。厌氧菌和深部真菌作为机体正常菌群常引起内源性感染，如腹腔、盆腔感染、菌血症等。 3、感染源 引起医院感染的病原体来源于住院病人、医务人员、探视者、陪护人员，来自于医院环境及未彻底消毒灭菌的医疗器械、血液制品的污染菌等，大多为条件性致病菌，且有程度不同的耐药性。 4、易感人群 免疫力低下状态的住院患者成为感染的易感人群，同时住院期间接受不同种类药物治疗和某些治疗措施为病原体感染创造了入侵和繁殖条件。 二、医院感染病原体的确定 1、感染菌的鉴定： 引起医院感染的致病菌的鉴定比一般的致病菌的鉴定要求要高，实验室必须鉴定到种的水平。细菌鉴定依据表型生化反应，八进制的编码鉴定法，必要时辅助血清学鉴定。 2、药敏试验的鉴定： 药敏试验的方法有K-B法、微量液体稀释法和E-test法，药敏试验的结果除了能提示用于控制感染的药物外，还提供感染菌的耐药谱，根据来自同一感染源的感染菌具有相同耐药谱的特征，作出医院内感染的判断。 3、耐药表型的检测： 医院内感染菌常常是一些耐药菌，实验室应对这些细菌的耐药表型进行检测。肠杆菌科（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、变形杆菌）应作超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）、耐糖肽类抗生素的肠球菌（VRE）。 4、医院内感染的分子生物学检测 ： （1）多位点酶电泳（multi locus enzyme electrophoresis, MLEE） 将菌株培养物破碎，离心取上清液，在淀粉胶上进行电泳，电泳完成后将胶切成小条，分别与不同的酶底物作用进行酶染色，不同的酶分子在不同的电泳位置显影，组成了菌株的电泳型。当酶分子的基因发生一个或多个位点变异时，电泳迁移率相应发生变化。 （2）限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 将菌株培养物破碎，提取DNA，以限制性内切酶进行切割后，在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳后作溴乙啶染色，通过分析电泳区带图谱对菌株进行鉴别；可以将电泳分离的核酸片段转印到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用标记的探针与之杂交，用于菌株的鉴别。 （3）多态DNA的随机放大(random amplification of polymorphic DNA,RAPD) 多态DNA的随机放大又称随机引物PCR，在菌株的DNA提取物中加入约10个碱基的随机引物，进行PCR扩增，然后将PCR产物进行电泳和溴乙啶染色，分析染色图谱可用于菌株的鉴别。 （4）脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE） 将菌体包埋于琼脂中，先后用酶破坏细胞壁和分解蛋白质，以切点较少的内切酶剪切细菌的DNA，以随时变更电场方向的电泳装置对大片段DNA进行电泳，根据电泳图谱对菌株进行识别。 （5）放大片段长度的多态性分析（amplified fragment length polymorphism, AFLP） 对菌株的DNA进行限制性酶切，然后用特定的引物从限制性片段中将相应的片段选出，经PCR扩增后再进行电泳分析。 （6）核酸序列分析(nucleotide sequence analysis) 用PCR的方法将菌株DNA的某一片段进行扩增放大，然后进行测序，对各分离菌株的序列进行比较。 三、药敏试验 药敏试验中药敏纸片选用：临床医生经常反映，实验室所报告的药敏试验结果，临床根本或很少使用这类药物，实验室药敏试验中药物是敏感，临床使用无效。如何联合用药、合理用药？实验室人员应根据可能的细菌种类、细菌的菌属，合理选用药敏纸片，报告检验结果。实验室应根据美国FDA推荐临床微生物实验室苛养菌和非苛养菌分组的药物选用，它将药物