成熟心肌细胞对早期胚胎或胚胎干细胞定向分化诱导作用的研究内科学专业论文.docxVIP

重庆医科大学硕士研究生学位论文成熟心肌细胞对早期胚胎或胚胎干细胞 重庆医科大学硕士研究生学位论文 成熟心肌细胞对早期胚胎或胚胎干细胞 定向分化诱导作用的研究 摘 要 目的拟证实成熟心肌细胞对早期胚胎或胚胎干细胞(ESCs)定 向分化存在特殊的诱导作用，为建立一套简单实用的胚胎干细胞移植 技术提供理论依据。 方法分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞，以DAPI(4’6．联眯．2．苯 基吲哚)染核作为细胞标记。分别应用自然合笼及超排卵技术获取昆 明小鼠的早期胚胎(8～16细胞期胚)与心肌细胞及相关心肌微环境共 培养；取昆明小鼠(3．5—4天)的囊胚培养后分离出ESCs，以1到2 代的小鼠ESCs细胞团与心肌细胞及心肌成纤维细胞共培养。录像动态 观察早期胚胎或ESCs向心肌细胞分化的情况；分别于共培养后3、7、 14天行肌钙蛋白T(cTnT)、洳肌动蛋白(a-Actinin)免疫荧光染色检 测。 结果 (1)早期胚胎与心肌细胞或心肌成纤维细胞共培养时，可 继续发育分化，所分化出的细胞无cTnT表达。(2)l代或2代的ESCs 细胞和／或细胞团与心肌细胞共培养约7天左右出现节律搏动的心肌样 细胞；观察至14天时，搏动频率约为30一50次／rain。最好实验批次， 可计数到1／4以上的ESCs细胞和／或ESCs细胞团出现节律性搏动； ESCs细胞和／或细胞团与心肌细胞共培养并添加O．6％的DMSO时，节 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文律搏动的心肌样细胞分化率未见显著提高。(3)心肌细胞诱导组，记 重庆医科大学硕士研究生学位论文 律搏动的心肌样细胞分化率未见显著提高。(3)心肌细胞诱导组，记 录已搏动和未搏动ESCs诱导分化后的心肌样细胞cTnT、0【．Actin蛋白 荧光染色阳性率为27％；ESCs与心肌成纤维细胞共培养后的成纤维细 胞诱导组，分化的细胞cTnT、Q．Actin蛋白荧光染色均阴性；0．6％DMSO 诱导组中约3％的分化细胞cTnT、仅．Actin蛋白荧光染色阳性；DMSO 联合心肌细胞诱导组，其结果与心肌细胞诱导组相似。 结论 (1)心肌细胞和心肌成纤维细胞所提供的微环境有利于 早期胚胎发育分化，分化出的细胞可以继续发育增殖。但是，不能诱 导出cTnT阳性表达的心肌样细胞，考虑主要是滋养层细胞的分化影响 了细胞间的直接接触，导致诱导失败。(2)未经建系操作的ESCs可被 诱导分化为节律搏动的心肌样细胞；成熟心肌细胞与ESCs共培养状态 下，成熟心肌细胞可诱导ESCs向心肌细胞分化，这种微环境下ESCs 向心肌细胞定向分化率显著高于自然分化组，即成熟心肌细胞是诱导 ESCs细胞定向分化中较强的诱导因素。 关键词：胚胎干细胞，心肌细胞，共培养，细胞分化 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文STUDY 重庆医科大学硕士研究生学位论文 STUDY ON THE EFFECT OF MATURE MYOCARDIAL CELL TO INDUCE THE EARLY EMBRYo oR ESCs DIFFERENTISTED DIRECTLY ABSTRACT Objective：To confirm the especial effect of mature myocardial cell to induce the early embryo or ESCs differentiated directly，to provide the theoretical basis about establishing a simple and applied technique of cellular transplanting of ESCs． Methods：Primary myocardial cell was isolated from Sprague—Dawley neonatal rats，and marked the cell nuclear with DAPI．The early embryo (8～1 6 cell stage)obtained from Kunming mouse through natural mating or superovulation respectively Was used tO cocultur with myocardial cell or correlated myocardial microenvironment；the first or the second generation of ESCs was obtained from the blastocyst(3．5～4 days)through serial subcultivation，which was cocultured w