分子生物学常用技术(简化版).pptVIP

DNA的体内复制 DNA的体内复制 Yeast two-hybridization 蛋白质相互作用的筛查方法 以特定蛋白为钓饵，筛选其相互作用蛋白 如何利用蛋白质组学方法进行功能分析？ 蛋白质芯片 抗原－抗体 鉴定蛋白质相互作用 鉴定蛋白质与小分子相互作用：代谢组学 检测酶活性：蛋白质功能的高通量分析 本章的主要内容是什么？ 通过本章学习了解了哪些核酸和蛋白质研究方法？ 什么是分子杂交？ 分子杂交的探针是什么？怎样进行标记？ 分子杂交有哪些基本方式？ 什么是 PCR？基本原理是什么？ PCR 反应体系是由什么组成的？ 本章的主要内容是什么？ 什么是 RT-PCR？能用来干什么？ 如何利用 PCR 进行核酸的定量分析？ 什么是基因芯片？ 什么是蛋白质组学？核心方法是什么？ 如何进行蛋白质相互作用的研究？ * 最常用的 PCR 是 RT-PCR RT-PCR：reverse transcription PCR 以 mRNA 为模板 先进行逆转录，再进行 PCR 为什么要以 mRNA 为模板？ mRNA 无内含子，克隆的基因可在原核表达 mRNA 的量代表了基因的表达水平 如何利用 RT-PCR 检测基因表达水平? 定量 PCR(quantitative PCR) PCR 产物的量与起始的模板量有关 利用 PCR 对模板 DNA 或 cDNA 进行定量测定 定量 PCR 一般用于特定基因 mRNA 水平的检测 RT-PCR 可用于基因表达水平检测 需设定内部参照物(reference gene)，如：GAPDH、actin、18s rRNA 等稳定表达基因 定量是相对的，一般是不准确的 为什么说 RT-PCR 定量是不准确的？ 指数扩增期，产物量与模板量成正比 进入平台期，产物量不能再反应模板量 不同样品进入平台期的循环数不同，难以选择测定的时间节点 有精确定量方法吗？ 实时荧光定量 PCR(real-time PCR)： 以产物量到达一定阈值所需要的循环数为定量标准 需要对 PCR 产物的生成量进行动态监控 如何进行产物量的实时检测？ 需要荧光标记探针与两侧 PCR 引物 探针标记有报告荧光与粹灭荧光 反应过程中探针被降解，报告荧光显色 可通过荧光定量 PCR 仪进行实时监控 巢式 PCR 可以提高扩增效率和特异性 Nested-primer PCR 内外两套引物分两轮进行扩增 在克隆一些低丰度基因时可以采用 经过两轮 PCR 扩增，具有更高的灵敏度 四条引物均与模板匹配，因此增加了特异性 可以利用多对引物进行多重 PCR 多重 PCR(multi-primer PCR) 多组引物同时进行的 PCR，可大幅度降低 PCR 反应的工作量 可以在组织切片上进行原位 PCR 原位 PCR(in situ PCR) 在组织切片或细胞涂片上进行的 PCR 方法 主要用于特定基因表达水平的原位分析 组织切片经过固定、蛋白酶和 DNase 消化后进行 RT-PCR 扩增 Sequencing：基因结构分析的最基本方法 主要方式： 化学降解法 酶法：Sanger 法/双脱氧链末端终止法 二代/三代测序技术 第三节：基因测序 适用于寡核苷酸片段测序的方法 基本反应： G：DMS G/A：哌啶 T/C：肼(低盐) C：肼(高盐) 一、化学降解法 Sanger 在 1977 年建立的方法，也称酶法测序 DNA 序列测定的最常用方法 二、双脱氧末端终止法 在反应体系中加入 2’, 3’ -ddNTP，由于其没有 3’-OH 而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止。 Sanger法测序 模板：单链→单双链均可 酶： Klenow →耐热 DNA 聚合酶 标记：同位素标记→荧光标记 电泳：平板电泳→毛细管电泳 4 泳道→单一泳道 酶法测序的自动化程度越来越高 二代测序技术(next-generation sequencing) 1 天完成全基因组测序 罗氏、Solexa、ABI 等公司各有不同技术 利用微珠或芯片实现大通量，边合成边测序 三代测序技术(next-next-generation sequencing)： 3 分钟完成全基因组测序 基于纳米微孔的单分子测序技术 二代测序与三代测序技术 第四节：DNA 定点诱变技术(自学） 目前主要用 PCR 方法进行定点诱变 也可进行突变基于的全合成 第五节：RNA 干扰技术 学习基因工程之后，在基因剔除技术部分介绍 第六节：生物芯片 生物芯片(biochip)：基于微电子技术和生物信息技术建立的高度集成化的生物样本分析方法 生物芯片是后基因组时代的利器 生物芯片有哪些种类？ DNA microarray Protein microarr