植物组织培养技术 Plant Tissue Culture.ppt

植物组织培养技术 目 录 一、实验目的 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 二、相关知识 三、实验原理 三、实验原理 四、试剂和器材 四、试剂和器材 四、试剂和器材 五、操作步骤 五、操作步骤 切开胡萝卜，在圆圈处取一块组织 P-木质部、C-形成层、X-韧皮部 五、操作步骤 形成层开始形成愈伤组织 C1-愈伤组织、C2-形成层 五、操作步骤 3-4周后完全形成愈伤组织状态（脱分化） 组织块失去色素 五、操作步骤 把脱分化后的愈伤组织转移到培养基上 五、操作步骤 两周左右开始再分化，长出幼苗 五、操作步骤 将幼苗移植到外部条件下培养（顺化） 五、操作步骤 顺化一个月后的胡萝卜植株 五、操作步骤 五、操作步骤 五、操作步骤 五、操作步骤 五、操作步骤 五、操作步骤 五、操作步骤 五、操作步骤 五、操作步骤 五、操作步骤 五、操作步骤 六、思考题 培养基配制(I)—母液配制： 按照MS培养基成分表, 配制分别配制培养基的母液。 1、大量元素母液(10倍液) 分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的（60-80℃）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水，定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用）。 2、微量元素母液(100倍液) 分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定溶到1000ml。 3、铁盐母液（100倍液） 称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O，溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。 培养基配制(I )—母液配制： 4、有机物质母液(100倍数) 分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。 除上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生物素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。 培养基配制(I)—母液配制： 5、生长素 如2,4-D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。 6、细胞分裂素 如激动素(Kt)、6-苄基嘌呤(6-BA)。准确称取20mg，先用2ml的1mol/ml HCL或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。 培养基配制(I)—母液配制： 取1000ml烧杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml,有机物质100倍母液10ml。此外,根据培养材料和实验目的还要附加一定量的生长素,细胞分裂素及蔗糖等,然后加水至1000ml,待蔗糖充分溶解后用1mol/L 的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8,最后加入琼脂粉6.5g,如用琼脂条,则要加8g。 培养基配制(II)—配制与分装： 将盛有培养基的烧杯在电磁炉上，煮至琼脂完全融化，补加蒸馏水至1000ml。 将配制好的培养基分装到培养用三角瓶中，每只100ml三角瓶约装40ml培养基。 分装时要避免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染。 培养基配制(II)—配制与分装： 1、把装好的培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖。 2、设置灭菌参数为121℃，20min，开始灭菌。 培养基配制(III)—灭菌： 1、取新鲜胡萝卜茎，用去离子水洗净。 2、在胡萝卜茎上切一块含有形成层的组织，放入磨口三角瓶中，倒入适量10%亚硫酸溶液，轻轻摇动15-30s。 3、倒去亚硫酸溶液，无菌水洗涤3-4次，彻底清除残留叶面和瓶内的亚硫酸溶液 胡萝卜的取材与处理 1、先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽。 2、放入培养瓶和灭菌后的接种用具(镊子、解剖刀、接种针)，把镊子、解剖刀、接种针插入内盛70%酒精的广口瓶中。 3、用镊子把胡萝卜夹入培养皿内的吸水纸上，吸干水珠，把胡萝卜切成含有“木质部”、“形成层”和“韧皮部”三部分的小块。 接种 4、小心打开三角瓶，把组织块投入瓶内，用接种针拨匀，盖上封口膜。 5、用记号笔在瓶壁上写明培养材料、培养基代号、 接种日期。 接种 注意事项 全部接种操作都是在无菌条件下进行的