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第8章 新品种培育 体外单倍体诱导通常是指利用离体培养花药或小孢子的方法，诱导形成单倍体植株。花粉植株的形态发生方式有三种：①愈伤组织型；②类胚体型；③混合型 单倍体育种是指将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯和二倍体，从中筛选出优良个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良形状的个体，作为杂交育种的原始材料。 一、 植物小孢子发育过程 首先，初生造孢细胞经过多次分裂产生小孢子母细胞。 小孢子母细胞发育到成熟的花粉粒的过程可分为三个时期： 第一期，小孢子母细胞通过减数分裂形成四分体; 第二期，四分体分离开后，单个小孢子继续发育; 第三期，小孢子发育成成熟的花粉粒。 二、花药和花粉培养 1、花药培养（anther culture） 花药培养比花粉培养快捷，是单倍体培养的主要手段。 花药再生植株的产生有两种方式，器官再生和胚状体再生。 胚状体再生有两个特点① 两极性② 与外植体的维管束无直接联系 2、 花粉培养（pollen culture） 花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。 （1） 裸子植物的花粉培养 研究相对较少，典型的树种有麻黄、银杏、紫杉、榧等。 （2）被子植物的花粉培养 被子植物成熟花粉不容易进行离体培养，通常采用特殊方法，如悬滴培养（Kameya等 ，1970）或看护培养（sharp等， 1972）。 水稻和烟草花粉可采用直板培养法进行培养。 3、小孢子母细胞培养 小孢子母细胞培养主要用于研究减数分裂和花粉发育。 1967 年Ito和Stern培养无瓣 延龄草和麝香百合的小孢子母细胞获得成功，得到了四分体小孢子。 Nitcsh等采用变温处理的方法改变小孢子母细胞的发育途径，并诱导出胚状体。 对大多数植物来说，小孢子分离系统还没有建立起来，目前一种有效的小孢子分离系统已经应用于油菜小孢子培养。 三、花药与花粉培养方法 1、材料的选择 （1） 材料的遗传变异 首先，不同物种之间花药培养的反应存在跟大差异；此外，同一属内不同种或品种之间也存在诱导性的差异。 母本材料的基因型是影响花药培养的关键因素，不同基因型植株的花药对培养的反应不同。花药培养的诱导率也与杂种优势有关，一般情况下杂种比纯种容易诱导。 （2） 母本生理状态的影响 母本生理状态直接影响花药培养力 母本的氮素营养水平是另一个重要的影响因素 （3） 花粉发育时期 被子植物的花粉发育过程经历三个阶段，即第一期四分体时期、第二期单核期（小孢子阶段）、第三期双核期和三核期（雄配子体阶段）。单核期又分为单核早期、但和中期、单核晚期。 对大多数植物来说，单核中期和晚期是诱导花粉胚或花粉愈伤组织的最佳时期，尤其单核靠边期是花粉诱导的关键时期。 不同植物的花粉对离体培养有其特定的、最敏感的发育时期，然而，对大多数植物，单核期的花粉比较容易培养。 具有无限数目花药的植物，取材比较方便，具有有限数目花药的植物，按顺序找出小孢子发育时期不同的花药。 将镜检结果与花蕾发育状态进行对比，发现花蕾状态与花粉发育时期的对应关系，为进一步取样培养奠定基础。 供体植物的遗传背景对单倍体的诱导影响甚大。 2、材料的预处理 （1）低温处理 研究表明，低温预处理能明显提高花粉胚的诱导率。 不同材料采用的低温处理温度和时间有一定差异。 低温处理提高花粉诱导率的作用机制存在两种观点：Nitsch(1973)和 Sunderland(1978)分别提出 （2）高温处理 （3）离心处理 离心对二核期花粉无效 （4）激光照射 （5）乙烯利处理 （6）甘露醇处理 卫志明等（1993）首先提出，甘露醇预培养对小麦游离小孢子培养有促进作用。 3、培养基 A、基本培养基 常用的花粉培养基本培养基有MS、Nitsch、B5、BN、BH、MB、N6、H、Miller等多种 （1）碳源：蔗糖是常用的碳源，蔗糖不仅作为碳源，同时也可调节渗透压剂。 （2）激素：在脱分化培养基中细胞分裂素和生长素共同作用是十分重要的；在分化培养基中，细胞分裂素是主要的诱导激素，一般也配合使用生长素；通常采用生长素单独或配合使用诱导生根，适用浓度0.025~3.0mg/L不等。 （3）附加成分 B、条件培养基 利用组织培养物产生分泌物进入培养基，使得培养基条件化，成为条件培养基。经过条件化的培养基可以促使培养细胞的分裂和分化。 异种花药、子房组织也可使培养基条件化，这揭示了植物组织在培养过程中分泌的某些物质对细胞分裂和生长普遍起作用。 4 接种与再生植株的培育 A、材料的灭菌处理 （1）5%~10%漂白粉水溶液的上清液浸泡10~15分钟； （2）8%~10%安替福民浸泡5~10分钟； （3）0.1%升汞浸泡10分钟