半滑舌鳎CynoglossussemilaevisCSFR2基因的重组表达及其蛋白.PDFVIP

第36 卷 第2 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.36, No.2 2 0 1 5 年 4 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Apr., 2015 DOI: 10.11758/yykxjz / 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) CSFR2 基因的 重组表达及其蛋白纯化与功能分析* 1,2 3 1① 王凯琳 胡乔木 陈松林 (1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071; 2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306; 3. 中国水产科学研究院长江水产研究所 武汉 430223) 摘要 通过对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)进行全基因组及转录组测序，预测了一个半滑舌鳎 性别相关基因CSFR2 ，目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究CSFR2 基因的功能， 本研究从蛋白层面入手，构建了原核表达载体pET-32a-CSFR2 ，转化到大肠杆菌E. coli 进行诱导表 达，用His Trap 进行蛋白纯化，SDS电泳检测诱导及纯化产物，并将表达纯化的CSFR2 蛋 白注射1 龄半滑舌鳎精巢。由于CSFR2 是一个性别相关基因，因此无法通过免疫反应来直接检测 其蛋白活性，本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Cyp19a 和Foxl2 的表达 量变化，来间接反应CSFR2 蛋白的活性及功能。实验结果显示，重组蛋白能够进入到活体细胞内 并发挥一定作用，在6–72 h 内对性别相关基因Cyp19a 和Foxl2 的表达有上调作用，说明CSFR2 蛋白具有生物活性，并能调节其他性别相关基因的表达量，间接促进雄激素转化为雌激素。本研究 进一步了解 CSFR2 基因在半滑舌鳎性别决定与分化中的作用，可为半滑舌鳎性别控制提供理论依 据，在人工诱导鱼类性逆转方面有重要应用价值。此外，本研究为蛋白活性验证提供了一种新方法。 关键词 半滑舌鳎; 性别相关基因; CSFR2; 重组蛋白; 生物活性 中图分类号 S961 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2015)02-0030-07 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目、舌 究其性别决定机制具有实际意义。 鳎科、舌鳎属，和其他硬骨鱼不同，半滑舌鳎的性别 目前，半滑舌鳎全基因组和转录组测序已完成， 决定类型为雌性异配型(ZW ♀/ZZ♂) ，并且具有明显的 克隆获得了 CSFR2 基因全长。为进一步验证 CSFR2 性别二态性，雌性比雄性生长迅速，且体型为雄性的 基因的功能，本研究从蛋白层面对该基因进行功能分 2–4 倍(Zhuang et al, 2006; Chen et al, 2009) 。然而， 析，将CSFR2 基因构建到原核表达载体pET-32a ，诱 除了染色体性别决定以外，在正常的养殖水温下(22 导表达融合蛋白，并检测其生物活性与功能。由于 ℃) ，有14%的ZW 型遗传性别为雌性的个体会发生 CSFR2 是半滑舌鳎性别相关基因，无法通过免疫反应 性反转，成为表型性别为雄性的个体(Chen et al, 来检测 CSFR2 蛋白的活性，因此选择通过半滑舌鳎 2014) 。由于半滑舌鳎性别决定机制复杂，同时由基 其他性别相关基因表达量的变化来检测 CSFR2 蛋白 因和环境因素共同作用，因此半滑舌鳎是一个用来研 的活性，间接反映出 CSFR2 基因的生物功能。 究性别决定机制以及性反转现象的典型范例。此外， Cyp19a(Deng et al, 2009)