细菌的分型及其检测技术.ppt

. 第四章 细菌的分型及其检测技术 主要内容 一、概述 二、细菌噬菌体分型的一般原则 三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术 四、细菌的噬菌体分型技术 五、噬菌体分型优缺点（自学） 噬菌体(bacteriophage;phage) 是一类能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体等微生物的病毒，属于专性细胞内寄生的微生物。 自然界分布广泛，凡有细菌的场所，均可能存在相应的噬菌体。 根据与宿主菌的关系分类 噬菌体与宿主菌共培养 液体培养基中 固体培养基上 噬菌体在细菌鉴定与分型方面的应用 (1)细菌型别与分型噬菌体裂解特异性稳定，分型结果重复性好。 (2) 噬菌体具有较高分型效率，能够区分菌株间的细微差别，能满足流行病学研究的需要。 (3) 操作方法简便易行，实验耗时短，结果记录简明。 (4) 方法应能标准化，以利结果的比较。 (5)所用噬菌体应易于获得较高效价，能较长时间保存，噬斑清晰、大小适中，使之便于观察和准确记录。 （一）噬菌体分离 （二）噬菌体纯化 （三）噬菌体的增殖、保存 （四）噬菌体的效价和裂解谱的测定 细菌素(bacteriocin) 是某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质，这种物质仅对与产生菌亲缘关系近的细菌有抗菌作用，而对产生菌本身不敏感。如大肠菌素、绿脓菌素、蜡样芽胞杆菌素等。 抗生素 抗菌素是细菌、真菌等微生物在生长过程中为了生存竞争需要而产生的化学物质,这种物质可保证其自身生存,同时还可杀灭或抑制其它微生物。细菌产生的有多粘菌素、抗菌肽等。 细菌素特点 抗菌范围很窄，在治疗上应用价值不大，但可进行细菌分型和流行病学调查。 细菌素分型方法 利用不同型别的细菌素产生菌测定试验菌的细菌素敏感模式（检测未知菌） 利用已知对不同型别细菌素敏感的菌株作为指示菌，测定试验菌产生细菌素的模式 （一）待测菌对细菌素敏感模式分型试验方法（绿脓菌素为例） （二）平板交叉划线分型法 适用于细菌素产生量不多的细菌 已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养24-48h 无菌水冲洗掉菌苔，放置2cm*2cm滤纸片，滴加三氯甲烷，灭菌 多种待测菌株与原产细菌素菌株成垂直交叉划线接种，培养24-48h，观察交叉点上是否有菌生长，判定待测菌菌型。 （三）待检菌产生细菌素对指示菌敏感模式分型方法 方法同平板交叉划线分型法 已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养24-48h 无菌水冲洗掉菌苔，三氯甲烷熏蒸灭菌 多种细菌素敏感的指示菌依次垂直交叉划线接种，培养24-48h，观察交叉点菌生长情况，判定产生细菌素试验菌菌型。 一、概述 二、纸片扩散法 三、稀释法 四、结核分枝杆菌药敏试验 细菌的药物敏感试验(drug susceptibility test) 是指在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力的试验，简称药敏试验。 药敏试验方法 纸片扩散法、稀释法、抗生素浓度梯度法（E-试验法）、联合药敏试验、自动化检测法、分子生物学方法等。 （一）基本原理： 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。 (二)培养基和抗菌药物纸片 1．抗菌药物纸片：商品化，选择直径为6.35mm，吸水量为20μl的专用药敏纸片，用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定要求。含药纸片密封贮存于超低温冰箱。 2．培养基：水解酪蛋白（M-H）培养基是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，4℃保存。 1. 在琼脂平板上挑取形态相同的菌落4～5个，接种于3～5mLM-H肉汤中，36℃培养4～8h，与标准比浊管比较，可用肉汤或生理盐水稀释至与0.5麦氏标准比浊管浊度相同 2.在15min内，用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于M-H琼脂平板上（注意：涂布要均匀、致密），待干 3. 镊子灭菌冷却后，夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域，即两纸片间距不小于24 mm，纸片距平板边缘不小于15mm。 36℃温箱培养16～18h观察结果。 （四）结果判断和报告 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。根据标准，作出“敏感”、“耐药”或“中介”的判断。 “敏感”（sensitive，S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制； “耐药”（resistant，R）：表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。 “中介”（intermediate，I）：表示测试菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使