分子克隆工具酶及其应用.pptx

分子克隆工具酶及其应用限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。分子克隆工具酶及其应用第一节 限制性内切核酸酶 一 . 限制性内切酶的发现 1.?细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的发现 H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。 二 . 限制修饰系统的种类1.?I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。2.?II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种基因位于质粒上。3.?III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 三. 限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。　例如：HindⅢ　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d ⅢSacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)四．限制酶的特点 1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiIGGCC N N N N N GGCC CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ ３）对称性—双对称 EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2.?末端种类 １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’ ３）?平齐末端 SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG CCC-5’ ４）非互补的粘性末端 ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(N)9 3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 3’-CCTAC(N)13 ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5’-CPyCGPuG-3’ CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG ５）相容性末端如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。