08-荧光原位杂技技术及其临床应用.ppt

FISH用于产前诊断主要探针 染色体数目异常是临床上最主要的染色体病，其中13号、18 号、21 号、X、Y 染色体数目异常最为常见， 由于13，18，21，X 和Y 这5 种染色体的非整倍体异常约占所有染色体异常的65％～80％，占染色体异常导致出生缺陷的85％～95％， 因此FISH 用于快速产前诊断主要是针对这5 种染色体设计使用荧光标记的探针。 FISH 用于产前诊断的指征 a.妊娠妇女血清学筛查 风险高危者（大于等于1/270)及临界风险者 (小于1/270至大于等于1/1000）。 b.妊娠妇女到预产期时高龄年龄≥35 岁。 c.双亲之一为易位携带者。 d.不良孕产史。 e.超声检查胎儿异常者。 FISH敏感度和特异度均较高 FISH 用于产前诊断检测的敏感度和特异度均较高。 例1. 有报道FISH 检测4 500 例未培养羊水细胞，对于常染色体的敏感度为92.6%，特异度为100％；性染色体敏感度为100％，特异度为99.9%。 例2. Tepperberg 等总结美国25 个实验室应用FISH 检测5 348 例羊水资料，结果敏感度为99.6%，特异度为99.98%，阳性预测值为99.8%，阴性预测值为99.96%。 例3. Caine 等回顾性分析24 742 例FISH检测羊水间期细胞的敏感度为99.54%，特异度为99.97%，阳性预测值为99.54%，阴性预测值为99.97%； 由此可见，FISH 用于快速产前诊断的准确性较高。 FISH产前诊断技术临床应用 染色体数目异常是引起新生儿先天性遗传病的主要因素之一。传统的羊水细胞培养、染色体核型分析是宫内产前诊断胎儿染色体疾病的主要方法, 但该方法所需时间长、技术难度大、易受培养条件的影响。对未经培养的羊水间期细胞进行荧光原位杂交检测, 快速诊断胎儿常见的三体型及性染色体数目异常, 具有快速、简便、敏感、特异性强等优点。 FISH产前诊断技术临床应用价值 正常情况下羊水失败率约为0.5%， 超过妊娠24 周后培养失败率升至10%。FISH 检测的成功率2019 年后陆续有大样本研究报道了较为一致的成功率，约为95%～98％。后随着商品化探针的上市，操作程序规范化后失败率大大降低。传统核型分析最少需要15 mL 羊水标本，而FISH 只需3～5 mL 羊水。 * * 荧光原位杂交技术及其临床应用 荧光原位杂交（FISH） 将分子带进细胞遗传学的领域 荧光原位杂交技术 90 年代以后, 随着分子生物学技术的提高以及向各学科的渗透, 出现了一种新的运用分子手段分析染色体异常的方法, 即: 染色体荧光原位杂交( FISH) 技术, 该技术不仅可用于中期分裂相, 还可在间期细胞显示杂交信号, 尤其适用于那些培养难以成功的各种组织细胞。 由细胞到DNA分子 荧光原位杂交技术的基本概念 1.脱氧核糖核酸(DNA)分子 2.脱氧核糖核酸(DNA)探针 3.脱氧核糖核酸(DNA)变性 4.脱氧核糖核酸(DNA)杂交 荧光原位杂交原理 FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸 为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未 知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的 杂交双链核酸。 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术（简称FISH）是用细胞遗传学和分子生物学的原理，通过荧光标记的核酸探针与细胞内的核酸序列杂交。借助荧光显微镜，在细胞和（或）组织中观察并分析细胞内杂交于靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息。 荧光原位杂交示意图 常见的荧色物 荧色物 激发（nm） 散发（nm） DAPI 达比 350 470 FITC 异氰酸荧光素 490 525 Texas Red 德克莎斯红颜料 596 615 荧光显微镜系统 探针的标记的种类及比较 1.探针标记方法主要有两类： （1）直接标记法，就是荧光素通过一些方法直接连接到核酸序列上。 （2）间接标记法，就是把地高辛或生物素等半抗原连接到核酸序列 ，然后在杂交过后的检测阶段，加入标记有荧光素的相应半抗原抗体参与反应进行检测。 探针的标记的种类及比较 2. 这两种标记方法相比较而言各有利弊。直接法方便、快捷且背景低，信号强度不及间接法强；间接法具有信号放大系统，信号强检测灵敏度高，但是间接法杂交过后检测步骤繁琐，背景信号强。近年来荧光的亮度和抗淬灭性的不断