《环境微生物的检测与分析》实验指导15年.doc

《环境微生物的检测与分析》实验指导 编者：吴方丽李欧 浙江理工大学生命科学学院 二零一四年十二月 中国浙江杭州 TOC \o 1-5 \h \z 的分离与测数 3 藏 14 实验三变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析技术及其在微生物种群多样性研究中的应用29 HYPERLINK \l bookmark46 \o Current Document \h 附录 各种培养基、试剂的配制 39 实验一 土壤微生物拮抗菌的分离与测数 一、 实验目的 1、 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。 2、 初步掌握从土壤中分离微生物和测数的基本方法。 3、 了解培养基的配制原理，掌握其配制过程和方法。 4、 掌握实验室几种灭菌方法及技术。 5、 掌握无菌操作技术。 6、 了解平板菌落计数的原理。 7、 识别土壤中几大类微生物的菌落特征。 8、 学习拮抗作用的试验方法，观察微生物间的拮抗现象及抗生素的抗菌作用。 二、 实验原理 自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类的微生物的混合 体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的 微生物群落屮获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离纯化。 在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，各种微生物混居生活在一起。其中生 活的微牛物的数量和种类极其丰富，因此土壤是人类开发利用微牛物资源的重要基地。 土壤中微生物的数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠的土壤中少。其生 理类群则与土壤的其它理化性质，如通气性、pH有关。例如在通气良好的菜园土中， 好气性微生物占有绝对优势。本实验以肥沃的菜园土为实验材料分离土壤屮的好气性细 菌、放线菌和霉菌，并进行数量测定。 分离微生物常用的方法有：稀释涂平板法、稀释混合平板法、划线分离法等。根据 不同的实骑材料可以采用不同的分离方法。其最终目的是在培养基上岀现欲分离的微生 物的单个菌落，必要时再对单菌落进行进一步的分离纯化。本实验分离细菌时采用牛肉 膏蛋白腺琼脂培养基、分离放线菌时釆用高氏一号琼脂培养基、分离霉菌时采用马铃薯 蔗糖琼脂培养基。 稀释平板计数法是根据微牛物在固体培养基上一个活的单细胞繁殖能形成一个菌 落这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个活的单细胞。计数时，首先将待 测样品制成一系列稀释液，再取一定稀释度，一定体积的稀释液接种到平板中，使其均 匀分布到平板屮的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目， 根据稀释倍数即可计算岀样品中的含菌数。由于此方法所计算的菌数是培养基上长岀来 的菌落数，故乂称活菌计数。一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品的检定，生物 制品检骑，土壤中可培养微生物含菌量测定及食品、水源的污染程度的检骑等方面。 拮抗作用是微生物之间普遍存在的一种相互关系。它是某些微生物生命活动中产生 的一种特异性代谢产物一抗生素，具有抑制或杀死另一些微生物的作用。能产生抗生素 的微生物称为抗生菌。 平板对峙法常用于拮抗菌对离体植物病原菌的拮抗作用的测定。其原理是，把抗生 菌与供试病原菌同时置于同一培养基平板上，由于抗生菌对病原菌的扌吉抗作用，抗生菌 菌落边缘与病原菌菌落边缘之间会产生一定的抑菌距离。抑菌距离越大，拮抗作用越强。 组织法常用于拮抗菌对活体植物病原菌的拮抗作用的测定，也可用于化合物的活性 测定。其原理是把抗生菌所产生的抗菌物质预先接种于即将发病的植物组织上或接种在 己发病的植物组织上，由于抗牛菌所产牛的抗菌物质对病原菌的拮抗作用，病原菌无法 致病或延缓病原菌的致病作用。 三、 实验材料 1、 器材：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、lmL的无菌吸管、10mL的刻 度试管、无菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH试纸、封口膜、记号笔、线绳、纱 布、培养皿、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、试管架、涂布棒、酒精灯、超净工作台、 火柴。 2、 试剂和材料：无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，银子，牛肉膏、蛋白腺、 琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、lmol/L NaOH、lmol/LHCK 75%洒精、KNO3、NaCl、 K2HPO4-3H2O MgSO4-7H2O FeSO4-7H2O^ 蒸憎水、新鲜马铃薯、10%酚駄、乳酸。 四、 实验步骤 培养基的配制 (1)配制牛肉膏蛋白腺(NA)培养基 牛肉膏蛋白陈培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。 配方如下：牛肉膏3g蛋白陈10g NaCl 5g琼脂15-20g水1000 mL pH 7.4-7.6 1、 称量药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入搪瓷缸中。牛肉膏和蛋口月东可分别放 在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入搪瓷缸。蛋白月东极易吸潮，故称量吋要迅 速。 2、 加热溶解 在搪瓷缸中