0403细胞的基本培养技术-文档.ppt

Section 3：细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求 原代培养操作 传代培养操作 细胞计数 细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法 能维持的代数一般是有限细胞系种族(主要):成纤维细胞 人,50; 猴,40; 鸡,37;鼠,8 部位:人: 胚肺 50±10; 肾8~19  猴: 肺 5; 肾 20; 耳 40条件:如表皮细胞 +EGF 从50代 增加至150年龄 模拟实验（2） 小鼠肝细胞和脾细胞原代培养两周后，进行传代培养 ◆肝细胞： ◆脾细胞： 细胞传代方法 根据细胞生长的特点，传代方法有3种： 1、悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2、半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3、贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液（含0.02% EDTA）。 贴壁生长细胞传代方法 1、吸尽（或倒掉）培养瓶中的培养液 2、加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3、吸去胰蛋白酶液，加入培养液（可终止胰酶的作用）。 4、用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5、吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6、加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7、将后者放入培养箱中培养。 动物细胞的传代培养 常用细胞培养技术 ◆ 悬滴培养 ◆ 培养瓶培养 ◆ 旋转管培养 ◆ 细胞同步化培养 ◆ 克隆培养（见后） Cell culture Chapter 4 Animal Cell Culture ◆ Biology of cells in culture ◆ Fluid for cell culture ◆ Standard cell culture techniques ◆ Establishing a cell line or cell strain ◆ Cell freezing and recovery ◆Animal Cell Engineering◆ Section 3：细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求 原代培养操作 传代培养操作 细胞计数 细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法 培养操作基本要领和要求（1） ◆无菌操作 防治污染；成功或失败的首要条件 ◆培养前准备 操作卡片 用品置于场地，然后消毒 操作野消毒 洗手和着装 火焰消毒 培养操作基本要领和要求（2） 动作准确敏捷 不用手触及已消毒物品 操作面布局合理 操作保持一定顺序 培养用瓶和吸管的放置 防止各种用液的交叉污染 不向操作野讲话或咳嗽 模拟实验（1） 某生物技术公司招聘操作面试： 小鼠肝细胞（组织块）和脾细胞原代培养 ◆操作前（准备工作）： ◆操作中（分离、培养的具体方法） ◆操作后（清洁） 1）培养前准备：制定实验计划和操作程序。 2）超净台要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。 3）个人进入无菌培养室原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装，开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁而灭消毒手和前臂。 4）实验中需保持无菌操作要求。实验前要点燃酒精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。 5）分别使用不同吸管吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液，而不能混用 6）不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。 7）注意操作时勿大声讲话或咳嗽。 Section 3：细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求 原代培养操作 传代培养操作 细胞计数 细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法 动物细胞培养过程图解 原代培养 Primary culture 概念 从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的时期，一个特征性的必然的生长阶段。 完成了从体内环境到体外环境的过渡和适应过程，恢复了分裂增殖与生长发育 的能力 取材——分离细胞——接种 含义:包含①原代培养实质是初次培养，即培养物接种到培养器皿  中就不再分割，任其生长繁殖②原代培养中的“代” 并不是指细胞繁殖的“代”数③原代培养过程中不分割培养物 不等于不更换培养液 建立方法:组织块法；分散(