分子分型方法在流行病学调查中的应用.ppt

. 分子分型方法在流行病学调查中的应用 细菌的分子分型方法 近年来分子生物学技术在各个方面得到广泛地应用，这些技术渗透到流行病学之中，形成了一门新的分支学科— 分子流行病学。分子流行病学中重要的一点是利用合适的分型方法对分离到的病原进行分析。 细菌的分子分型方法 一种方法是否能应用于分子分型以及其分型效果如何大致可以从以下几个方面考虑： 细菌的分子分型方法 1、分型力 是指对所分析菌株能够得到明确的阳性结果的能力。 2、重复性 是指当重复测试相同菌株时能够得到相同结果。 3、鉴别能力 是指区别非相关菌株的能力。理想的分型方法应该能识别每一无关的分析菌株。 4、结果易于解释 这是非常重要的。 5、快速、廉价、技术简单。 细菌的分子分型方法 肠道致病性的分型技术大致如下： 1、表现型分型方法。 抗生素敏感性 噬菌体分型 细菌的分子分型方法 2、基因分型技术， A 质粒图谱分析 B 以PCR为基础的分型方法，如随机扩增多态性分析法（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）； C 限制性片段长度多态性（RFLPs）的Southern Blot分析。 D 脉冲场凝胶电泳方法（PFGE）。 细菌的分子分型方法 1、抗生素敏感性试验 抗生素敏感性测试是临床微生物实验室常规应用的方法，手工和自动的方法都可以做到，也可以进行严格地质量控制。操作简单，相对经济。 细菌的分子分型方法 如果要进行详尽的流行病学分析，抗生素敏感性试验资料的用途就相对有限了。这不仅是因为表现型有变种的存在，更是因为现代的医院中，存在中非常大的抗生素的选择压力。一个特定的菌株，可以通过多种遗传学机制，“突然”对某种抗生素表现出抗性。 细菌的分子分型方法 另一方面，如果没有特定的选择压力，这些遗传元件也可以丢失（如R因子）。所以，不同的菌株可能具有相同的抗性图谱，在患者不同时期分离到的同一种细菌菌株，也可能会表现出不同的抗生素敏感性图谱。 细菌的分子分型方法 噬菌体分型分析 噬菌体裂解细菌细胞具有一定的特异性。一些噬菌体只能感染一个种或属的细菌，一些噬菌体可以裂解同一种细菌的不同株。因此，可以利用不同噬菌体的裂解细菌细胞的特异性，可以分离、筛选一组噬菌体，用于传染源的追踪和菌株的分析。 细菌的分子分型方法 缺点是除了一些参比实验室外，很少实验室能拥有种类比较完全的噬菌体，在应用方面受到了很大的限制。其次，噬菌体分型技术的要求比较严格，需要经验丰富的工作人员。同时， 噬菌体分型常常会遇到多样性结果， 需要仔细推敲。还有，使用认可的噬菌体，许多菌株不能获得满意的结果，不得不考虑使用其它噬菌体， 给结果的分析带来困难。 细菌的分子分型方法 英国把噬菌体分析和PFGE方法结合使用， 对E.coli O157：H7大肠杆菌进行分型。可以把E.coli O157：H7大肠杆菌至少分为66个噬菌体型。 小肠结肠炎耶尔森菌亦可用噬菌体分型。 细菌的分子分型方法 基因分型技术 质粒图谱方法 最先应用于流行病学研究的以DNA为基础的技术就包括质粒的分析。分别提取分离菌株的质粒DNA，在琼脂糖凝胶上电泳分离，测定质粒的数目及大小。该方法简单经济，易于推广。临床分离的E.coli O157：H7大多数菌株都含有质粒，可以应用质粒图谱法来进行分型。 细菌的分子分型方法 然而，细菌的质粒可以自发丢失（如小肠结肠炎耶尔森菌质粒的自然丢失率在10%左右，且这种丢失是不可逆的）、获得质粒。还可以在细菌之间进行接合转移，这就使得质粒图谱分析的结果有时候难以解释。 另一个问题是质粒DNA构型可能发生改变。 细菌的分子分型方法 此外，使用质粒图谱分析方法不能够区分那些分子量相同而DNA序列不同的质粒，或分子量不同而有较高同源性的质粒。 针对这一情况，人们把质粒用限制性内切酶消化，再用电泳分析限制性片段的数目和大小，这样质粒分析的可重复性和分辨力都会得到很大的提高。 细菌的分子分型方法 基于PCR的分型系统 随机引物PCR（AP-PCR），也就是随机扩增多态性DNA分析（RAPD）。使用那些不针对任何已知遗传位点的短引物（通常8-10bp），可以随机地与染色体DNA结合，并有足够的亲和力启动聚合酶反应。 细菌的分子分型方法 然而，在实践中，用AP-PCR获得可重复的高分辨力的结果还存在一定的困难。 第一，如果条带的强弱可以证明菌株之间的差异时，我们很难比较和解释图谱； 第二，由于某些产物可能代表效率相对低的反应，技术因素的微小改变就可以导致不同的扩增反应中一个特定菌株产生的实际片段差别很大。 细菌的分子分型方法 另外一个影响RAPD可重复性的因素或许是由质粒编码的片段的扩增，质粒是可以丢失或获得的，有文献报道质粒的影响