课件：环介导等温扩增技术.ppt

环介导等温扩增（LAMP）检测金黄色葡萄球菌 摘　要:建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的LAMP方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测并与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为61℃,只对金黄色葡萄球菌进行扩增;灵敏度高,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8～9cfu /mL时仍能检出。LAMP方法检测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄球菌的新方法。 简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin—resistantStaphylococcus aureus,MRSA)大量出现。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起食物中毒的主要原因,每年都有肠毒素中毒的报道,已经成为世界性的卫生问题。因此建立快速、简便地检测金黄色葡萄球菌的方法一直是研究的热点。目前,金黄色葡萄球菌的检测方法有很多,主要有分离培养法、琼脂扩散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、测试片法、PCR 法等。 环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中,如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合症病毒 、志贺氏菌属和大肠杆菌 。本研究针对金黄色葡萄球菌的femA基因设计一套LAMP引物,对金黄色葡萄球菌进行检测,优化反应条件,确定检测特异性,对lamp法与PCR法的灵敏度进行了对比。 LAMP的技术原理： LAMP方法的特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物, 利用一种链置换DNA 聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件( 60 ～65 ℃)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应,直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断是否发生反应。短时间扩增效率可达到10^9 ～10^10个拷贝。 不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。 材料与方法 材料与仪器 材料： 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 、大肠杆菌( Escherichia coli) 、铜绿假单胞菌( Pseudom onas aeruginosa) 、沙门氏菌( Salm onella enterica) 、沙门氏菌( Salm onella sp ) 、荧光假单胞菌( Pseudom onas f luorescence ) 、恶臭假单胞菌( Pseudom onas putida ) ，沙门氏菌( Salm onellaHJ- 004) 、志贺菌( Shigella spp ) 、单增李斯特菌( L isteria mmonocytogenes ) 、大肠杆菌( Escherichia coli) ETEC: 44247 ( 6: 15: 16 ) 、EPEC: 44706( 111: 58 ) 、单增李斯特菌( L isteria m onocytogenes) ，蜡状芽孢杆菌(B acillus cereus ) 、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus ) 、乳酸乳球菌( Lactococcus lactis ) 、嗜热链球菌( S treptococcus therm ophilus KLDS ) 、双歧杆菌(Lactobacillus bif idus KLDS) ，B stDNA 聚合酶(New England B iolab ) 、DNA markerDL2000 仪器： DYY- 10C型电泳仪 UVP凝胶成像仪　 2. 实验方法 ⑴ DNA模板的制备 　 煮沸法将对数生长期的金黄色葡萄球菌等细菌培养物,取1mL 于EP管中12000 r /min,离心5min 收集菌体, 加入TE - Trinton200μL混匀后,于沸水中5min,后12000 r /min 离心5min,取上面50