分析所分离之蛋质纯度测定未知蛋白质分子量.ppt

SDS PAGE 事前準備工作 測試Sample: 原液(0%)、salting out(60%、100％) Ion exchanger 濃縮液、gel filtration ( protein con、specific activity最高 ); marker 、α-amylase(標準液) 。 適度的濃縮或稀釋？( 0.5 μg/ μl) gel filtration（ protein con、specific activity最高）濃縮？ Sample 處理 接近5μg / well 以10條蛋白質條紋(band) 20μl/well ; 每個Sample 4重複（最好 x5) α-amylase 15μl+5 μl sample buffer(x1) α-amylase 75μl+25 μl sample buffer (x5) ★α-amylase:泛指不同的樣本 75μl(sample 50 μl +H2O 25 μl ) ★ sample con:0.5 μg/ μl(理想濃度) Sample 處理 α-amylase 75μl+25 μl sample buffer (4x) Electrophoresis(電泳）原理 SDS電泳原理 SDSMarker HRP顯色原理 SDS及Western blotting顯色結果 A： SDSCBG 染色結果 B： Western blotting顯色結果 1.?-Amylase(1μg); 2.Gel filtration比活性最高 3. Gel filtration 蛋白質量最高 4. Ion Exchange比活性最高 ; 5. Ion Exchange蛋白質量最高; 6. 100% 鹽析(3μg) ; 7. 55% 鹽析(3μg);8. 原液(3μg); 9. Marker; 10.原液(0.6μg) BIO-RAD迷你電泳槽裝置 鑄膠-組裝 * * 分析所分離之蛋白質純度 ? 測定未知蛋白質分子量 蛋白質電泳 Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS) 製備gel 處理Sample Loading sample SDS將gel移入staining solution destaining solution 直至染色對比清晰為止 Data判讀乾燥gel (蛋白質先定量) gel轉印PVDF膜 Western blotting HRP detection Data判讀 實驗流程: 加蓋 95oC，5分鐘後，馬上放在冰上 20μl(Well) loading SDSSDS：Protein = 1.4：1 （結合重量比） 單位質量蛋白質的陰電性均相同(charge/mass ratio) ? 單位質量蛋白質於電泳時所受電場的引力均相同 –O-S-O-(CH2)11-CH3 極性部分 SDS的結構 O O 非極性部分 Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)-陰離子界面活性劑 SDS 1. SDS 2. ?- mercaptoethanol (還原劑,使蛋白質之雙硫鍵打斷) 3. bromophenol blue (小分子指示劑) 4. Glycerol（增加溶液的比重） Sample buffer (4X) SDSSample之處理原理 s s SH SH 沸水浴中5分鐘 Sample buffer β-mercaptoethanol 蛋白質 鏈狀(peptide) 泳動率 (v) ～ 外加電壓 (E) × 分子淨電荷 (q) 分子泳動時與介質間之摩擦力 (f) 單位質量蛋白質的陰電性均相同, 每個蛋白質移動速度均相同 如何分離分子量大小不同的蛋白質? Sample loading 150V (100V) 150V Stacking gel Separating gel 帶電分子在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳 泳動率 (v) ～ 外加電壓 (E) × 分子淨電荷 (q) 分子泳動時與介質間之摩擦力 (f) Shape v = Eq d6prh v : 分子移動速度 E/d : 電場強度 q : 分子淨電荷 r : 圓形分子半徑 h : 溶液黏度 Electrophoresis (電泳) Acrylamide聚合作用 參與反應之化學物質: Acrylamide (A) ：形成聚合物鏈 Bisacrylamide (B) ：形成縱向架橋（cross-linka