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T细胞检测技术 机体接受外来抗原及自身抗原刺激后,通过细胞免疫和体液免疫及相关系统协同作用,对抗原产生应答。 T 细胞应答: T细胞增殖 分泌细胞因子 细胞毒效应 表达特定表面标志 淋巴细胞 DNA合成 分化 母细胞 刺激物 细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松 一、淋巴细胞增殖实验 1、原理 (1)形态学检测 2、检测方法 方法学评价 优点:形态学方法简便易行,普通光学显微镜便能观察结果,适于基层实验室应用。 缺点:是依靠肉眼观察形态学变化,判断结果易受主观因素影响,重复性和准确性较差。 (2)3H-TdR掺入法(MTT法) PHA 淋巴细胞(54h) 3HTdR掺入 (MTT被还原) 收集细胞,检测β射线(490nm吸光度) 优点:3H-TdR掺入法敏感性高,客观性强,重复性好。 缺点:但需一定设备条件,同时还存在放射性核素污染问题。 原理: CFSE等染料可连结到细胞内蛋白的氨基酸群(PKH26能插入脂膜),并随细胞分裂而分配到子代细胞中,每分裂一次,荧光强度减少一倍。 方法学评价 优点:操作简单;重复性强;安全; 缺点:CFSE可能干扰细胞增殖 (3)CFSE(PKH26等)染色法 二、T细胞分泌功能的检测 T细胞经各种丝裂原或特异性抗原刺激后,分泌的各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平,从而间接反映T细胞功能。 1、生物活性检测 对于依赖于该细胞因子而增殖的细胞,细胞增殖程度与细胞因子含量呈正相关。 方法学评价 优点:敏感(pg);显示细胞因子的活性; 缺点:影响因素多(同一细胞分泌多种细胞因子,多种细胞因子呈现相同功能,细胞因子及其相应受体同时分泌); 2、免疫学检测 (1)ELISA: 操作简单,非特异性影响大; (2)ELISPOT: 高度的敏感性,可重复性强,抗原特异性精确; (3)ICS:可同时检测产生细胞因子的细胞表型;需要样本量大于ELISPOT,破膜后的细胞不能做进一步功能检测; 优点:简单,适用性广,应用特异的单克隆抗体,可检测单一细胞因子的含量; 缺点:无法反应细胞因子的生物活性;不同单克隆抗体检测的结果不同;敏感性稍差(100pg) 方法学评价 (1)Realtime-PCR (2)分子杂交 2、分子生物学检测 三、T细胞介导的细胞毒实验 特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别靶细胞表面特异性抗原,通过Fas途径及颗粒酶途径,介导靶细胞溶解。 1、51Cr释放实验 铬酸钠(Na251CrO4)中的六价铬能被活细胞摄取,并在细胞溶解后以三价铬的形式被释放。 方法学评价 优点:灵敏、特异,是CTL活性测定的经典方法; 缺点:操作繁琐;放射性;靶细胞51Cr自发释放; 2、IC Assay(In vivo cytotoxicity Assay) 表达特定抗原的肿瘤细胞系经CFSE标记后,皮下注射入小鼠,被小鼠体内抗原特异性CTL作用24小时后,取出肿瘤细胞,检测其CFSE含量。 方法学评价 优点:反应体内杀伤效果; 缺点:影响因素多; 四、T细胞表面标志的检测 特异性T淋巴细胞活化需要第一信号和第二信号。因此检测CTL表面特异性受体或相关的表面标志可以反映CTL的活化状态。 1、Tetramer技术 模拟T细胞活化的第一信号,构建荧光标记的MHC-肽复合物,被特异性T细胞识别。通过检测标记的荧光,反应活化的特异性T细胞。 方法学评价 优点:简便,快速,敏感 缺点:成本高,受HLA型别的限制 2、表面标志CD107a/b的检测 CD107a/b表达于T细胞内的质膜上,随着脱颗粒作用,一过性表达于细胞表面;T细胞表面CD107a/b的检测可反应T细胞的溶解靶细胞效应。 方法学评价 优点:简便,快速,敏感,不受HLA型别的限制 缺点:脱颗粒作用的非特异性 谢 谢
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