抗原的表达和纯化.pptVIP

抗原蛋白的表达和纯化;一、抗原组生产流程;可溶蛋白具体生产步骤;二、实验原理;三、基因的表达;（一）乳糖操纵子(lac operon)的结构;（二）阻遏蛋白的负性调节;有乳糖存在时;（三）CAP/CRP的正性调节;+ + + + 转录;lacI-系统中，不管是否存在乳糖，三种乳糖分解代谢有关的酶得到持续表达。 lacI+系统中，当葡萄糖存在时，不表达三种酶；然而，当存在乳糖而又缺乏葡萄糖时，这三种酶得到表达。;乳糖操纵子受到两种调节：阻遏蛋白的负调节和CAP的正调节，有两道控制开关，只有两道开关同时打开时, 即只有在缺乏葡萄糖并存在乳糖时,基因才能够转录。;（四）乳糖操纵子诱导物;（五）影响蛋白表达的因素;四、亲和层析纯化可溶性蛋白;亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的蛋白的一类特殊层析技术。;通常两个分子间特异亲和力的形成有两种情况： （1）两个分子之间，其构形有如积木般的互补，因为范德华力的关系，产生特异亲和力 （2）两分子之间，因为某些基团间产生了二级键，造成了吸引力。 亲和层析法按亲和配基的亲和力大小可分为两类（1）特异性配基亲和层析法，其配基，包括生物素、激素、抗原等，KD值为10-7～10-15。 （2）通用性配基亲和层析法，其配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金属离子等，KD值为10-4～10-6。;利用了GST与GSH间酶与底物构象互补的特异性结合特性，将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。其结合力是范德华力，结合力弱且需较长的结合时间，但特异性高。 GST fusion protein的洗脱原理是通过调节GSH浓度及洗脱时间将目的蛋白洗脱下来,洗脱液中的还原型GSH与beads上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白，从而将目标蛋白洗脱。;此图为Glutathione sepharose的终端结构，谷胱甘肽通过SH基团与sepharose基质的环氧乙烷基团通过环氧激活特异偶联到sepharose上。;GST亲和纯化中常见的问题1;GST亲和纯化中常见的问题2;（四） 6X HIS Tag蛋白的纯化 ——特异性配基亲和层析法;6x His fusion protein的洗脱原理是通过高浓度的咪唑洗脱目的蛋白，洗脱液中的咪唑通过和金属离??结合而高效地替换掉His标签融合蛋白。 由于一些宿主细胞蛋白上也含有组氨酸，可以结合在beads上，洗脱时也会被洗脱下来（特异性差的原因）。因此在洗涤液中加入低浓度咪唑，可以避免宿主细胞蛋白的结合。;HIS标签蛋白亲和纯化中常见的问题1;HIS标签蛋白亲和纯化中常见的问题2;谢谢大家！