冷冻电镜.pptx

冷冻电镜的发明及其在生物学的应用;冷冻电镜是什么？;我们或许在不久的将来就能获得生命复杂机制的原子级分辨率的图片了;冷冻电镜技术获2017诺贝尔化学奖;上世纪50年代，利用X射线成像技术解析蛋白质结构，人们才首次得以拍出蛋白质晶体的螺旋状结构图片。 X射线晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。其中关键步骤之一即是，为获得可供X射线衍射的单晶，需要将纯化后的生物样品进行晶体生长。现实情况却是，目前很多复杂的大分子物质难以获得晶体。 ;上世纪80年代初，核磁共振成像技术问世，人们得以对溶液中和固态的蛋白质进行成像研究，不仅进一步认识了蛋白质的结构，更获得了蛋白质如何运动及与其他分子相互作用的基本了解。 ;被认为比晶体结构更能够描述生物大分子在细胞内的真实结构，并且能获得氢原子的结构位置。缺点则在于蛋白质在溶液中往往结构不稳定而难得获取稳定的信号。; X射线晶体学法和核磁共振技术均对蛋白质的纯度、结晶性和绝对量有较高的要求，使得图像分辨率难以提升，更是无法获得蛋白质结构的动态变化。 因此，无论是X射线晶体学成像还是核磁共振，都不能让研究者获得高分辨率的大型蛋白复合体结构，生物结构学领域的发展也因此受困于成像技术。;电子显微镜;3、电子显微镜观测蛋白质分子有活性的生物大分子遇到的问题？ 第一个问题是真空问题，电子显微镜的电子只能在真空中飞行的时候才能保持稳定的动能。而蛋白质这类生物大分子一般处于溶液中，在真空环境下，溶液会挥发出来，污染电子显微镜。液态水在电子显微镜的真空管里蒸发，会使得生物大分子瓦解。 第二个问题是电子打在蛋白质这类生物大分子上容易把蛋白质打坏了，因为电子的能量比较高，而生物大分子一般依靠氢键来形成它的空间结构，氢键的能量很低，电子打上去以后，氢键就被打断了。 　 第三个问题则更加严重，因为蛋白质分子这类生物大分子是有活性的，它们是运动的，电子打上去反射回来的方向会因为分子的运动而变得杂乱无章。;冷冻电镜的诞生;亨德森将未脱离细胞膜的细菌视紫红质直接放置在电子显微镜下进行观察，借助表面覆盖的葡萄糖防止真空干涸，并采用强度更低的电子束流，得出细菌视紫红质在细胞膜上是规整排列且朝向一致。之后，在前述Aron Klug等人提出的三维重构技术的基础上，亨德森和同事获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像。 亨德森所发展出来的方法也具有其局限性，这是因为他所研究的蛋白本身的特性让研究者能够采用所谓“冷冻电子断层成像术”来测定其结构。简单来说，研究人员要转动细胞膜，从不同角度对蛋白拍照，最终构建出蛋白的三维结构。这种方法只适用于排列有一定规律的蛋白——如果它们是杂乱无章的，这种方法就难以奏效了。;1981年，弗兰克完成了单颗粒三维重构算法及软件Spider，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式将图片拟合成更加清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，在同一种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D结构图像。弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基础。;在1980年代初，雅克·杜伯切特成功将水玻璃态化，他将水快速冷却，在生物样本周围以液态形式固化，使生物分子即使在真空中也能维持天然形态。 雅克·杜伯切特（Jacques Dubochet）的重要贡献则是在真空环境下使生物分子保持自然形状。 ;一般情况下，通过氢键的相互作用，水分子会在凝固过程中形成有序排列，形成晶体。而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前就让其凝固，将生物样品浸入事先经液氮冷却的乙烷中，就能使水迅速冷却、在数毫秒之内完全凝固，这种方式得到的就不是晶体而是无定形态，而玻璃也是处于无定形态，玻璃化名称由此而来。生物样品嵌在无定形冰中，堪称留下了真实的一瞬间。 1982年，迪波什开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品。;在1990年，理查德·亨德森成功地使用电子显微镜拍摄到原子级分辨率的蛋白质三维图像，并提出了实现原子级分辨率冷冻电镜技术的可行性理论。 冷冻电镜的雏形基本建立，总的思路为 样品冷冻（保持蛋白溶液态结构） 冷冻成像（获取二维投影图像） 三维重构（从二维图像通过计算得到三维密度图） ; 基于三位科学家的这些重大发现，电子显微镜自此得到全面优化，并在2013年，研究者们终于获得了理想的原子级别成像，用以制作生物分子的三维结构图像。过去几年中，科学文献充满了导致抗生素耐药性的蛋白质、寨卡（Zika）病毒表面等各种图像，生物化学正在面临爆炸性的发展。 2014年利用冷冻电镜三维重构技术确定蛋白质TRPV1结构，标志着冷冻电镜跨入“原子分辨率”时代。;冷冻电镜的工作流程：;图1 冷冻电子显微学解析结构基本步骤;冷