PCR实验及遗传性诊断试验.pptVIP

遗传性疾病的PCR诊断 ——α-地中海贫血的诊断 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR在临床上的应用 在遗传学疾病上的应用：地中海贫血 在肿瘤研究中的应用 检测病原体 基因分型 地贫的病理基础 α地贫：α珠蛋白基因缺失或缺陷使α珠 蛋白链的合成受到部分或完全抑制，造成α链 的合成减少，过剩的β链聚合成四聚体，在红 细胞内沉积，使红细胞变形性降低，不易通过 微循环及脾窦与脾索间的基膜而造成红细胞的 过度破坏。 β地贫：β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白链 合成受到部分或完全抑制，过剩的α链聚合成 不稳定的四聚体，在红细胞内沉积，造成无效 造血和红细胞的过度破坏。 操作步骤 1.DNA的制备 2.建立PCR体系 3.PCR扩增 4.琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 1.DNA样本 ①正常α珠蛋白基因（αα/αα） ②东南亚缺失型α地中海贫血（-SEA／αα） ① ② 2.PCR 体系建立（分别建立两个体系） Buffer 2.5ul ×5=12.5 Mg2+ 2ul×5=10 引物A1B 2ul×5=10 引物A4 1ul×5=5 引物A9 1ul×5=5 dNTP 2ul×5=10 DNA模板 1.5ul×5=7.5 H2O 12UL×5=60 TaqDNA聚合酶 1ul（含1U） 3.PCR扩增 95℃ 预变性 5min 95 ℃ 变性 30s 63 ℃ 退火 60s 72 ℃ 延伸 30s 72 ℃ 延伸 10min 4.琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，核酸染料 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：100V,20min 观察：紫外灯下观察，照相 PCR结果判断 M：Marker 2000bp DNA ladder， 1：正常人（基因型：aa/aa）； 2：东南亚缺失型a-地中海贫血-1（基因型：--SEA/aa）； 3、Bart’s 水肿（基因型：--SEA/--SEA/）。 铺 胶 凝胶凝固后取出梳子 加缓冲液 准备样品 点 样 电 泳 * * 生物化学与分子生物学教研室 周娟 three steps: How PCR works Denaturation (变性): 90～97℃ Annealing (退火): 45～65℃ Extension (延伸): around 72℃ 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 PCR的基本原理 模板DNA 95℃ PCR反应过程 95℃ 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq 72℃ 第2轮结束 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 Last Step : 72 ℃ 5-10 min After 25~30 cycles ? 30轮循环 扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR产物每轮循环增加一倍 30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplic