内源性活性物质.pptxVIP

体内药物分析内源性活性物质的分析;内源性活性物质;蛋白质类内源性活性物质的分析;Western Blot;荧光探针;荧光探针;与G蛋白偶联受体相关的内源性活性物质对心肌细胞功能和形态的影响;免疫组织化学法;免疫组织化学染色法;免疫组织化学染色法;发光免疫测定luminescence immunoassay;LIA;luminescent immunoassay ;层析 chromatography ;双向凝胶电泳（2D胶电泳）的基本原理;IPG 胶的材料是 Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH 3~10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。;2D胶电泳数据库;细胞因子的测定ELISA系列的试剂盒;ELISA法酶联免疫吸附剂测定是主要的测蛋白的方法;ELISA 的原理;;;免疫测定在临床检验中的应用的可行性;;举例：多糖蛋白的检测ELISA试剂盒法;RIA法儿 放射免疫测定/放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA) ;　　RIA法基本原理： 　　在放射免疫分析的实验中，加入超量的标记抗原*Ag与未标记抗原Ag（即：待测抗原）与较少量的抗体（Ab）竞争性结合。 　　如果实验结果所计量到的结合物（*Ag-Ab）放射活性较高，表示待测物的浓度较低。 　　如果所计量到的结合物放射活性较低，则表示待测物的浓度较高。 藉由标准 曲线图的分析，可以推算出待测物的浓度。 ;用 ELISA 法及 RIA 法检测;活性蛋白及其降解产物的测定;血浆纤维蛋白原水平与纤维蛋白 体聚合功能的测定;血浆纤维蛋白原降解产物测定;血浆纤维蛋白原降解产物测定;炎症细胞因子;生物活性法儿测定验证因子;本法系根据在不同白介素-2 (IL-2)的浓度下，其细胞依赖株CTLL-2细胞存活率不同，以此检测IL-2的生物学活性。 ;试剂 (1) RPMI1640培养液 取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105 IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。 (2) 基础培养液 取新生牛血清(FBS) 10ml，加 RPMl 1640培养液90ml。4℃保存。 (3)完全培养液 取基础培养液100ml，加重组人自介素-2至终浓度400～800IU。4℃保存。;(4) PBS 取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃ 15分钟灭菌。 (5)噻唑蓝(MTT)溶液 取MTT 0.1g，加PBS溶解并稀释成20ml，经0.22pm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。 (6)裂解液 15％十二烷基硫酸钠溶液，使用期限不得超过12个月。 CTLL-2细胞 应为偏酸性、略微浑浊液体，传代后48～60小时用于重组人白介素-2生物学活性测定。 ;标准品溶液的制备 取重组人白介素-2生物学活性测定的国家标准品，按使用说明书复溶后，用基础培养液稀释至每lml含200IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。每孔分别留50ul标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 ;供试品溶液的制备 将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成每lml约含200IU。在96孔细胞培养板中。做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50ul供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 ;测定法 CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养至足够量，离心收集CTLL-2细胞，用 RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配制成每lml含6.O×105个细胞的细胞悬液，置37℃、5％二氧化碳条件下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50ul，于37℃、5％二氧化碳培养18～24小时。 ;然后每孔加入 MTT溶液20ul，于37℃、5％二氧化碳培养4～6小时后，每孔加入裂解液150ul，于37℃、5％二氧化碳条件下保温18～24小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，放入酶标仪，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并