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基因芯片技术及临床应用 府伟灵 西南医院检验科 一.概述 随着人类基因组测序计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定。 在GenBank数据库中已含有300万个序列，总数超过22亿个碱基对，其中包括19种不同生物体的完整序列、近9 000个已知功能或已推测功能的人类基因序列。 基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速增长。 然而如何充分利用新序列信息资源，怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成为生命科学工作者的共同课题。 已建立的诸如Northern印迹、RNA酶保护实验、S1核酸酶分析、噬斑杂交以及狭线印迹等方法不能提供足够通量来有效地利用新的基因组学的资源。为此，必须发展高通量或平行监测基因表达的新方法。 基因芯片技术正是在这样的背景下应运而生。 早在80年代初期，有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因大量的遗传信息进行分析和检查。 但直到1994 年Pease等人创造的光导原位合成高密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作技术问世之后，才使该设想逐步成为现实。 因此可以说光导ODTA化学合成法，为基因芯片技术奠定了基础。 现在全世界已有十多家公司从事基因芯片研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表。 二.基因芯片的定义 又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。 三.基因芯片相关技术及其进展 基因芯片制备技术 靶基因的制备 杂交和检测 基因芯片设计 杂交图像分析 …… 1.基因芯片的主要类型 基因芯片视分类方法不同可分为不同类型 2.基因芯片的制备 基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸阵列 制造基因芯片首先要解决的技术问题就是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探针 原位合成 直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针 合成点样 将已经合成好的探针定位在芯片上 原位光刻合成 由美国Affymetrix公司开发 把玻璃基片上的活性羟基修饰上光保护基团，此光保护基团可被一定波长的光激活并脱保护。 根据所要制作的阵列的需要设计光刻掩膜。将掩膜（M1）覆盖在修饰过的基片上，用光照射使曝光区域的基片表面脱除保护基团而形成活性羟基（1-2）。 引入5`端被X基团保护、3`端被活化的单核苷酸dNTP，使dNTP的3`端与基片上的活性羟基缩合，洗去未有效结合的dNTP（3）。 更换掩膜M2，重复1-2，直到所需要的探针阵列合成完毕（4-6）。 使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。 某一含ｎ个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。 例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536（即216）个探针。 原位喷印合成 芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。 采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。 分子印章多次压印合成法 根据所需微阵列，设计有凹凸的微印章，然后根据预先设计在制备的各级印章上涂上对应的单核苷酸。 按照设计的顺序将不同的微印章逐个依次压印在同一基片上，得到256×256阵列的高密度基因芯片。 采用了平面微细加工技术，可实现大批量生产。通过提高集成度，降低单个芯片的成本 可组装大量的（104--106种）生物分子探针，获取信息量大，效率高，特别适合于基因信息的采集。 结合微机械技术（MEMS），可把生物样品的预处理，基因物质的提取，扩增，以及杂交后的信息检测相集成，制备成微物芯片。 合成点样 合成点样技术在基因芯片尚处于实验研究阶段时是唯一的芯片制造手段，曾一度被原位合成技术的光芒所掩盖。 随着原位合成技术缺点的暴露和自动化技术的进步，合成点样技术又重现生机。 微型机械点样法 是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。 目前，除Affymetrix等研究和生产基因芯片的少数大公司使用原位合成外，其他中小型公司和实验室研究中仍然普遍采用合成点样法。 微型机械点样法 该技术由Shalon和Brown于1995年发展起来的另一类具有生命力的基因芯片制备技术。 美国Synteni公司最终发展出商品仪器，完成其商品化。 通过毛细作用使用点样针将生化物质转移到固体基底表面（点样针与基底表面接触）。 第一轮结束后，清洗点样针进行下一轮操作。 机器人控