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第三章 基因克隆载体 基因克隆载体(gene clone vector): 通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。也称DNA克隆载体。 必备条件： 1、克隆位点(一个或多个) 2、能携带外源DNA片段进入受体细胞: 能自我复制，或整合到染色体随受体细胞DNA复制而复制。 3、有选择克隆子的标记基因 4、安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞) 意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。 按克隆载体的来源分： 质粒～ 病毒或噬菌体～ 质粒与病毒或噬菌体DNA组成的～ 质粒与染色体DNA片段组成的～ ３.１ 质粒克隆载体 定义： 以质粒DNA为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和cDNA基因文库。 ２、分子大小： 100～102 kb ３、复制 特点：在宿主细胞内进行单向复制。 质粒和宿主细胞双重遗传系统控制复制强度： 拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定。 严紧控制型：1～数个拷贝；大质粒 松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。 经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。 （２）质粒复制的控制因素 cop基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。 ４、质粒的不亲合性 亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒 不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒。 意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒 ５、质粒迁移 （１）接合质粒： 含tra基因→合成细胞表面物质（鞭毛）→质粒DNA入受体细胞 含tra基因的质粒称为接合质粒。如F、Ti等 不含tra基因的质粒称为非接合质粒。如ColE1、pPbS等 （２）迁移作用： 不含tra基因而含bom（oriＴ）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开oriＴ位点，非接合质粒借助接合质粒tra基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称～ ６、显性质粒和隐蔽质粒 宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。 显性质粒 Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap/Amp （抗性质粒） 氯霉素Cm/Cap 卡那霉素Km/Kan 四环素Tc/Tet 链霉素Sm Col质粒（产大肠杆菌素） Ｆ质粒（引起细胞结合的育性质粒） 降解毒物的降解质粒 Ｔi质粒 隐蔽质粒 蓝藻内源质粒 二、质粒克隆载体构建的基本策略? １、克隆位点——组装MCS连杆 ２、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ３、选择标记基因——抗性基因，(Lac Z′基因) ４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb转化率↓↓ ５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等 三、质粒克隆载体构建 过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组） 构建原则： 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子。 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件。 3、组装合适的选择标记基因。 4、选用合适的启动子。 5、构建过程力求简单。 代表性实例 （一）pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建 Ⅰ、pBR322构建※ 目标是缩小基因组的体积，移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，限制酶识别位点。 质粒载体命名法则： “pBR322” p：质粒（plasmid ) BR：两位主要构建者 322：实验编号 ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂。衍生的pMB1为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好的选择标记基因和克隆位点）。 pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧型，含有Tcr 基因。 构建过程(出发质粒：pMB1) R1（沙门氏菌中分离） 变异 R1drd19 （含易位子Tn3 Apr） R1drd19 Tn3 ColE1 pBR322的三个亲本：pMB1、 pSC101、 pSF2124 pBR322分子大小：4363bp pBR322优点 （1）较小