第三章 蛋白质分离纯化.pptVIP

蛋白质分离和纯化 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 (1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； (2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。 (3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。 1．蛋白质的分离步骤 (1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。 (2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。 (5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。 2．蛋白质的纯化方法 根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀 。 因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。 沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。 2．蛋白质的纯化方法 蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀 阴离子效果：NH4+K+Na+ 阳离子效果：PO43-SO42-Cl- 常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。 2．蛋白质的纯化方法 在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且需要在低温条件下进行。 2．蛋白质的纯化方法 蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。 当蛋白质混合物溶液的pH 被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该pH 的蛋白质仍然留在溶液中。 该法适于在等电点pH稳定的蛋白质。 2．蛋白质的纯化方法 利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。 常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。 2．蛋白质的纯化方法 透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。 2．蛋白质的纯化方法 超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。 其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器板式超滤器。 超滤膜的截止分子量有100万、50万、30万、10万、5万、1万、5千和1千 2．蛋白质的纯化方法 两种亲水性高分子或一种高分子聚合物与一种盐溶液混合后，因疏水性差异而分层。不同的蛋白质在疏水层的溶解能力不同而被萃取。 目前主要采用两种体系 聚乙二醇－葡聚糖 聚乙二醇－磷酸钾 2．蛋白质的纯化方法 由于蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同，用有机溶剂、表面活性剂、水构成的反相胶束提取某些蛋白质。 将表面活性剂溶解于有机溶剂中，等体积加入到蛋白质水溶液内，混合后可使某些蛋白质萃取到反相胶束内。 2．蛋白质的纯化方法 最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa压力下，CO2处于液体状态，温度为31.1°C，当压力或温度发生改变时， CO2处于气－液中间态，具有溶剂性能，可以使许多蛋白质及有机物质溶解在某一状态。经过泵出、升温等步骤即可分离出来。 2．蛋白质的纯化方法 利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 离子交换树脂包括两大类： 1、阳离子交换树脂（如羧甲基CM纤维素等） 2、阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基DEAE纤维素等） 2．蛋白质的纯化方法 层析条件的选择A、交换剂的选择——根据被分离对象带负电的分子用阴离子交换剂带正电的分子用阳离子交换剂B、交换剂颗粒大小的选择粒子的大小影响分辨率和流速粗粒子装柱不紧密，单位体积的交换容量小，易引起区带分散，分辨率低，但流速快。细粒子交换容量大，分辨率高，但流速慢。 C、层析缓冲液的选择 考虑缓冲液种类和pH 用阴离子交换剂时，选阳离子型缓冲液（磷酸、醋酸） 用阳离子交换剂时，选阴离子型缓冲液（ Tris 胺盐、吡啶） 根据交换剂上交换基团的pK值确定所用pH 用阴离子交换剂时，pH小于pK， 用阳离子交换剂时， pH大于pK 同时保证被分离组分不失活，有足够大的溶解度 柱子的选择 柱床体积至少比结合所有样品需要的大2-5倍 直径和长短根据上样量选择 2．蛋白质的纯化方法 此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由葡聚糖、琼脂糖或聚