第五章 基因克隆与鉴定.pptVIP

(3)大片段酶促法 　将目的基因两条链均分成40-50碱基长度的单链DNA片段，分别进行化学合成，然后用Klenow和T4—DNA连接酶补平。这种方法虽然需要合成大片段的DNA单链．但拼接模块数大幅度减少，较为适用于较大的目的基因合成。 在目的基因化学合成前，除了按上述三种方法对模块大小及序列进行设计外，通常在每条链两端的模块中额外加上合适的限制性酶切位点序列，这样合成好的双链DNA片段只需要用相应的限制性内切酶处理即可方便地克隆到载体分子上进行表达。 * 缺点 起始材料需要?g级量mRNA; 　　　 SSH差减克隆片段较小，不容易获取cDNA全长序列。　　　　　 应用表达文库分离克隆的目的基因 表达文库的构建不仅需要将外源基因片段插入载体启动子的下游，而且必须按正确的取向和读码结构插入，以保证产生正确的蛋白质； 利用抗体筛选； 测定蛋白质的功能； 带有特定蛋白质结合位点的DNA片段； 利用检测特异表达产物如抗体技术等进行筛库时，要求C库为表达文库，而传统建库技术在构建表达文库时，能得到的正确表达信息很低，这是因为： 1，加接头时是在cDNA的两端同时进行，因此无法保证cDNA插入载体时，不出现反向插入，而反向接入载体的那些cDNA不能正确表达，因而有50％的可能丢失。 2，表达时3个碱基代表一个氨基酸，不同的表达框架会得到不同的产物，因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1／3的可能得到正确的产物．虽然一度有ABC表达载体的解决方法，但是一段DNA同时插入3个载体的机会是有限的。 筛选cDNA表达文库的第二种方法是测定蛋白质的功能； 用放射性标记的，带有特定蛋白质结合位点的DNA片段； 第二节 基因文库构建 一、基因文库的分类 1、根据基因类型，基因文库可分为基因组文库及cDNA文库。 基因组文库：指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。 cDNA文库：指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 ??? 基因组文库根据DNA来源又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。 2、 克隆文库及表达文库 从基因文库的功能上看可分为克隆文库及表达文库。 克隆文库由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片断大量增殖。 表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元件外，还具有控制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。表达载体又有融合蛋白表达载体及天然蛋白表达载体之分。 从克隆文库中分离目的克隆时主要利用核酸探针，可以是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可以是同种或同属生物的同源序列探针 从表达文库中分离目的克隆时，因克隆片段的表达产物蛋白质具有抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以利用免疫学探针及生物功能进行筛选。表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因的分离。 二步甚至三步原位杂交法,可以在最短的时间内完成全基因文库的筛选，其程序如下: 第一步制备高密度平板，使每块平板密集分布5000-10000个菌落或噬菌斑，此时虽然菌落或菌斑相互重叠，但仍可进行原位杂交； 第二步由感光放片上的斑点位置在原杂交阳性平板的相应区域内挖下固体琼脂，并用新鲜培养基洗涤稀释； 第三步将稀释液再次涂布平板，使每块平板只含有200-500个可辨认的菌落或菌斑. 第四步用相同的探针进行二轮杂交，直至准确挑出期望的重组克隆。 基因文库重组克隆的排序 染色体走读法(chromosome Walking)，其原理如图所示。 从某一基因组文库中任取一重组克隆，提取其重组DNA，并将插入片段两个末端的DNA区域(0.2kb-2kb)次级克隆在新的质粒DNA上进行扩增，然后以这两个末端DNA片段为探针，分别搜寻基因组文库。杂交阳性的重组克隆中必定含有携带与探针片段重叠的另一个DNA片段。在一般情况下，这个DNA插入片段的一段位于初始重组片段的内部，另一端则是新出现的DNA区域，以此区域为探针第二轮杂交基因组文库，又可获得第三组DNA插入片段。重复上述操作即可将重组克隆双向逐一排序。 染色体走读法具有一定的局限性，即在真核生物尤其是高等哺乳动物基因组中，存在着大量的重复序列，它们短则数十碱基对，长则高达数kb。如果所选用的探针片段含有这种重复序列，染色体走读法便不能有效进行下去。在此情况下，往往需要对已排序的DNA片段进行序列分析，准确定位众多重复序列两侧的非重复DKA区域，并以此为探针继续搜寻基因组文库。 此法是根据可能的序列合成出6～10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物）作为合成第一链cDNA的引