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第二章 基因操作的主要技术原理 基因操作技术主要包括 （1）DNA分子的切割、连接、转化 （2）核酸分子杂交，凝胶电泳以及序列分析，基因的人工合成，PCR扩增等 第一节 核酸的凝胶电泳 第二节 核酸分子杂交 第三节 细菌的转化 第四节 DNA序列分析 第五节 基因扩增 第六节 基因的定点诱变 第七节 蛋白质与DNA相互作用的研究方法 第一节 核酸的凝胶电泳 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。 2、琼脂糖凝胶电泳 （2）分辨能力 同凝胶的浓度相关，能分辨200-50kb的DNA片段，浓度越低，孔隙越大，分离的DNA越大 熔点在65oC的琼脂糖凝胶，熔解后可在37oC保持液体形态，可直接用来回收DNA分子。 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N?，N?-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。 4、脉冲电场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE） 5、EB染色 6、其他染色方法 SYBR Green I 核酸染料 高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无需脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析。 SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 银染色 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收. DNA条带大小及量的估算 6、RNA 电 泳 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水（0.1％ 焦碳酸二乙酯）来配制所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解； 因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 第二节 核酸分子杂交 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 一、DNA/DNA印迹杂交——Southern Blot 紫外线交联法：利用DNA分子上一小部分的胸腺嘧啶残基同尼龙膜上的带正电荷的氨基之间形成交联键。 电泳凝胶预处理： 为了使大小不等的DNA都得到转移，要对凝胶作预处理，用0.25M HCl在溶液中作短暂的脱嘌呤处理后进行碱变性，使DNA分子发生断裂利于转移，并且碱性条件下的单链状态易于杂交 二、RNA/RNA印迹杂交－Northern blotting 1、原理 1979年，J. C. Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern blotting。 四、 Probe (探针) Notes Probe is a specific DNA or RNA fragment which can bind with the sample DNA or RNA for detection. eg：ATCCGATCG Source of probe synthesized, cloning genomic DNA or cDNA, as well as RNA. Probe must be labeled(标记) before hybridization. radioac