六、克隆基因的表达.pptVIP

由大肠杆菌质粒、2?m质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 酵母选择标记 2?m质粒 如pYF92: pBR322 2?m 酵母his 3+ （4）附加体型载体(YEp) 2?m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2?m 。含有自主复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维持稳定）。 特点： ①很高的转化活性（103-105转化子/微克DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。 YEp24 Leu- 酵母 原生质体 感受态 酶去壁 CaCl2、 PEG 整合到染色体上， 或独立在酵母细胞内 转化 Leu营养缺陷型 培养基筛选 转化子克隆生长 酵母载体 大肠杆菌 提取 插入外源基因 鉴定克隆 发酵表达 外源基因产物 分离、纯化 2. 酵母转化和表达的一般过程 （1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。 3. 酵母表达系统的特点 ②常常发生质粒丢失。 ③重组蛋白常常超糖基化 ①表达量普遍低。 （2）缺点 每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖， ④分泌困难。 正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。 分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙， HIV-1抗原 丙肝病毒蛋白 诊断试剂 HIV-1外壳蛋白 疟原虫环子孢子蛋白 乙肝病毒表面抗原 疫苗 名称 种类 4. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白 凝血因子VIIIa ?1抗胰蛋白酶 集落刺激因子 成纤维细胞生长因子 胰岛素前体 血小板源生长因子 类胰岛素生长因子 胰岛素 上皮生长因子 人类治疗用蛋白药物 （1）细胞质内表达 例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达： 5. 在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式 超氧化物 H+ H2O2 H2O 过氧化物酶 表达出的SOD修饰正确： 起始氨基酸被切掉， 第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。 SOD(超氧化物歧化酶) 宿主： 亮氨酸合成缺陷型酵母。 GAPD： 甘油醛磷酸脱氢酶 （2）表达分泌型蛋白 在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。 需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。 方法： 构建载体 在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys-Arg相连。 前导肽（leader peptide）： 蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。 信号肽的切割： 前导肽 Lys-Arg 重组蛋白（水蛭素） 内切蛋白酶 6.其它酵母表达系统 （1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达 在大型发酵反应器中容易生长； 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总蛋白的40%！ ①嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点 HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。 Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。 His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。 3’-aox1：整合到特定染色体的位点序列。 ②表达载体构建（整合型）： 诱导物：甲醇。 产量： 9×106剂疫苗/240L发酵罐。 整合到染色体中 （2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达 作为饲料添加剂促进反刍动物消化。 产量：10L，200h连续发酵产出50g溶菌酶。 二、昆虫培养细胞表达系统 1. 杆状病毒（Baculovirus） 广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。 （1）侵染周期： 两种形式 ①单独病毒粒子形式 病毒 粒子 宿主细胞 病毒 粒子 侵染 释放 病毒 粒子 宿主细胞 侵染 宿主细胞 侵染 合成多角体蛋白 裂解 释放 多面体溶解 一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV） ②多面体形式 （2）杆状病毒的表达特点 ①感染后36-48h，病毒开始合成大量的 多角蛋白。 ②多角蛋白的启动子特别强。 ③多角蛋白基因可以被替换掉而不影响 病毒的繁殖。 多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。 3. 转化子筛选 通过显微镜检查看是否有多面体形成。 源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。 2. 最普遍应用的宿主细胞株 （1）转移载体的构建 大肠杆菌质粒，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。 4. 杆状病毒转化载体 杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能