第四讲 基因工程动物细胞培养制药工艺.pptVIP

固定床反应器： 填料为无细胞毒性的生物兼容性可附着细胞的惰性材料，可以是不锈钢、玻璃陶瓷和塑料和合成高分子材料。 与流化床反应器的区别为固定床反应器使用实心载体，流化床反应器使用有孔载体。 现用多级流化床和多孔微球培养。 （五）中空纤维生物反应器 一个特制的圆筒，内部装有数千根中空纤维管束。 接种孔 水套层 产物出口 培养基入口 产物出口 培养基入口 内膜 外膜 腔室 细胞 培养基分散后,灌入床层。纤维管壁薄，半透膜，截留不同分子量。 纤维管的空腔组成的内室：灌流含氧气的培养基 纤维管之间的空间组成的外室：细胞生长。 细胞接种于外室，贴附在纤维外壁，吸收从内室渗透出来的营养成分，生长繁殖。 1－3周后可占据所有的纤维空间，并在纤维外壁表面上堆积成多层，细胞密度可达108/ml。 细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无法进入内室，产物只能在外室积累和浓缩。 细胞代谢的废物是小分子物质，可渗透进入内室，从内腔开口排出，避免了对细胞的毒性。 在收获时，打开纤维管之间的外室开口，产物就流出来。此时虽然细胞停止分裂，但细胞的存活、健康和核形态不变，代谢和分化功能仍可保持数月。 纤维材料:聚砜、丙烯共聚物、聚丙烯、纤维素、醋酸纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯等。纤维素亲水性强，对渗透性影响较大，不适合于Vero细胞及其他贴壁细胞培养。醋酸纤维和聚甲基丙烯酸甲酯亲水性弱，极性大，适宜于贴壁细胞培养。 优点:占地小，产量和质量高，成本低。 不足:不能重复使用，不耐高压灭菌，只能用环氧乙烷等消毒剂灭菌，不能取样检测。 中空纤维反应器是模仿了生物体内毛细血管系统，应用广泛，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。已有多家公司生产制造和销售中空纤维生物反应器，其发展的趋势是达到高密度培养的目的。 第五节 动物细胞的增殖行为与培养过程动力学 一、动物细胞的增殖周期 单细胞增殖周期： 细胞间期 间期1(G1)、 DNA合成期(S期)、 间期2(G2) 细胞分裂期（M期）。 M期为有丝分裂期，超螺旋化的染色单体，经过前期、中期、后期和末期，被纺锤体拉向两极，中间形成细胞板，一个细胞分裂成两个子细胞。 M期一般时间很短，为0.5～1小时。 同一类细胞的周期及其各期持续时间是一定的，但不同类型的细胞分裂周期及各期时间都不同，差异主要取决于G1期，而S和G2期相对稳定。 对连续细胞系，失去了细胞周期控制，培养条件及培养基成分会影响细胞周期。当人工培养条件不适，细胞将发生程序化死亡即凋亡过程，整个细胞分解后被膜包裹形成凋亡小体。在培养过程中，缺乏生长因子或血清、营养受限和逆境等均可引发凋亡发生。 二、悬浮培养细胞生长动力学 体外培养的细胞是以群体形式进行增殖和生长的，其动力学过程与单细胞微生物的生长相似。动物细胞培养的核心参数是活细胞浓度，可用细胞比生长速率（μ）、比死亡速率(Kd)和活细胞分数(fv)来描述，计算生长动力学。 1．悬浮培养细胞生长一般动力学 充分混合的悬浮培养游离细胞的反应器，假设流加操作时流出率为0，分批操作时流加率和流出率均为0，密度不变，反应器内则质量守恒： V：反应器内的培养液体积， Fi：流加新培养液的体积速度， Fo：消耗培养液的体积流速。 假定总细胞处于平衡状态： 总细胞的积累速率=细胞的流加速率－细胞的流出速率＋细胞生长速率－细胞裂解速率。在不进料情况下，总细胞平衡： N：细胞总浓度， uap：表观比生长速率，包括细胞的生长和死亡。 只有活细胞才能分裂，并假定活细胞不发生死亡： μ为真实比生长速率;Nv为活细胞浓度; Nd为死 细胞浓度;kl为死细胞比裂解速率。 活细胞占主导，死细胞裂解可忽略，即k l ＝0，那么 注意事项： 细胞只利用L型氨基酸，不能利用D型，对于DL混合型氨基酸，使用量应该加倍。 谷氨酰胺溶液中很不稳定，要单独配制成浓缩液。 NaHCO3一般配成3.7％、5.6%、7.4%三种浓度，过滤除菌或高压灭菌，4度保存，使用前加入，调节培养基pH。 为了优化细胞生长环境，还添加其他成分，如嘌呤和嘧啶类，维生素C、谷胱甘肽、巯基乙醇。 一般情况下，培养基成分如氨基酸、维生素、葡萄糖、缓冲液等、补充因子几类，先配制成高倍浓缩的母液，过滤灭菌，冷藏。使用时按一定比例稀释，配制成工作液。 第二节 动物细胞增殖生长的动力学过程 一、单细胞生长增殖周期 从一个细胞分裂形成两个新细胞的过程为一个细胞周期或一个细胞世代。单个细胞周期包括细胞间期、细胞分裂期，间期又包括间期1、DNA合成期和间期2三个时期。 不同的细胞类型其分裂周期及各期的时间都不同，培养条件及培养基成分也会影响细胞周期,一般地动物细胞分裂周期为12－48小时,典型的细胞周期为24小时。 对连续细胞系，失去了细胞周期