第二章 基因工程的主要技术原理.pptVIP

一 凝胶电泳 (一) 基本原理 电泳：分子在电场中以一定的速度移向适当的电极的过程。 迁移率（泳动率）：电泳分子在电场作用下的迁移速率或在一定时间内所迁移的距离，或者每单位电场强度下带电粒子的运动速率。 U= v / E = q / 6πηr 颗粒带电荷的密度愈大，泳动速率愈快；颗粒半径愈大，与支持物介质 摩擦力越大，泳动速度愈小 ，即泳动率与颗粒的分子大小，介质粘度成 反比；与颗粒所带电荷成正比。 摩擦系数: 是分子的大小、极性及 介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。 （五） 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出来的线性多糖聚合物，其作为电泳介质的密度是由琼脂糖的浓度所决定的。经过化学修饰的低熔点（LMP）琼脂糖结构上比较脆弱，在较低的温度下便会熔化，可用于DNA片段的制备（回收）电泳：熔点62~65度，溶解后在37度时持续保持液态数小时，25度时可保持液态10分钟。 DNA和RNA分子是多聚阴离子，所以，电泳时会就向正电极方向移动。 （八） 分子生物学实验试剂的保存和冰上操作 常用试剂：4 度保存为主； 各种酶类：-20 度保存为主； 菌种保存：-70 度以下超低温保存或4 度保存。 酶反应一般在恒 温水浴内进行： 2 常见几种核酸分子杂交技术 1）Southern blotting ：1975年由E.Southern首先设计出来的一种用于检测DNA样品中特异序列及其位置的技术。 2）Northern blotting : 1979年由J.C.Alwine等人发明的用来检测特异性探针对应基因的表达产物RNA的方法。即，将RNA分子从电泳凝胶转移到适当的滤膜上，进行核酸杂交的一种方法。实验过程基本与Southern blotting。 3）dot blotting（斑点印迹杂交）和slot blotting(狭线印迹杂交）：通过抽真空的方式将加在多孔滤膜进样器上的核酸样品直接转移到适当的杂交滤膜上，然后进行Southern或Northern blotting的方式同特异核酸探针杂交的方法。适合进行定量分析。 4）colony and plaque blotting (菌落和噬菌斑印迹杂交）：把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜上，使溶解变性的DNA同滤膜原位结合，再与特异性探针进行杂交的方法。 2、转化方法： DNA测序流程 DNA提取 目的片段扩增 电泳分离 胶回收 （2）合成寡核苷酸引物： 在待测DNA片段的3’-端合成一段互补的寡核苷酸引物，其顺序可为待测DNA片段3’-端的一段已知顺序，也可为一段M13噬菌体的顺序。可利用DNA合成仪自动合成。 （3）模板-引物杂交： 将待测单链DNA模板与寡核苷酸引物混合，并在适当温度条件下进行保温处理，使引物与DNA单链模板的3-端进行杂交。 （4）互补链的延长和终止： 将上述杂交混合液分为四份，每份混合液中均加入DNA聚合酶，四种dNTP，一种带放射性同位素标记的脱氧核糖核酸（如α-32P-dATP）。此外还需分别加入一种双脱氧核糖核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP）。然后在适当温度条件下延伸互补链，就可得到四组分别以A、G、C、T、终止的长短不一的互补链的混合物。在互补链合成时，掺入的是双脱氧核糖核酸，由于缺乏3`-和2`-OH，导致互补链合成终止。 （5）电泳分离： 将四组含有长短不等的反应混合物在同一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，即可将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离开。 （6）放射自显影： 将电泳凝胶与X光胶片压在一起，低温下自显影数天，即可得到放射自显图谱，通过该图谱即可直接读出核苷酸的排列顺序。 3 DNA序列的自动化分析 近年来，通过采用不同的荧光染料标记四种不同的双脱氧核糖核苷酸，其反应混合物可在同一区带上进行电泳分离，然后用计算机进行阅读和分析，可大大提高测序速度，一个熟练的工作者一天可分析1万个核苷酸顺序。 ABI全自动测序仪：电泳系统，激光检测系统，电脑，彩色打印，DNA序列分析软件，DNA片