第九章基因工程药物.pptVIP

* * 1.无性繁殖系的组建 2.基因工程药物的生产 3.基因工程药物的检验 基因工程药物：将生物体内生理活性物质的基因，利用重组DNA技术加以改造，然后使其在细菌、酵母、动物细胞中大量表达的新型药物． 第九章　基因工程药物 1.无性繁殖系的组建 1.1 人胰岛素工程菌的组建 1.2 人α2b型干扰素工程菌的组建 1.3 集落刺激因子工程菌的组建 (1)胰岛素的结构及其生物合成 1.1人胰岛素工程菌的组建 (2)人胰岛素的生产方法: A. 化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。技术可行，但其生产成本奇高。 B. 化学转型法制人胰岛素 猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，可将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素。但工艺复杂，产品的价格不菲。 C. 基因工程法制人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别。 a. A链和B链分别表达法： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%－20%,采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 b.人胰岛素A链和B链同时表达法： c.人胰岛素原表达法： 由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上，每克最终产品的成本仅50美元。 1.2 人α2b型干扰素工程菌的组建 (1)人α2b型干扰素基因的获得： 　应用PCR的方法，从人的染色体片段获得。 (2)重组表达质粒的特点： 　　　　　　具有双SD序列。 　　　　　　抗病毒活性高 构建过程见书P172图9-2 1.3 集落刺激因子工程菌的组建 (1)RT-PCR法制备GM-CSF cDNA 从正常人血中分离出单核细胞，提取总RNA； 引物设计： 　引物１：5‘端增加有EcoRⅠ酶切位点，起始　 　　密码子，５个组氨酸密码子和凝血酶切位点 　引物２：5‘端加一个终止密码子和一个BamHⅠ 　　酶切位点 PCR扩增产物和质粒pBV220双酶切后,重组连接，挑选氨苄青酶素抗性转化子，经酶切筛选、鉴定，阳性重组子命名为pGM09． (2)GM-CSF重组表达载体的构建 (1)rhG-CSF基因工程菌的培养与发酵 1)发酵用工程菌种的筛选 将保存的菌种接种到LB琼脂平板上，过夜培养。挑取单菌落进行液体培养，取少量经热诱导培养后，用SDS分析选取表达量最高的克隆作为发酵用种子． 2)发酵培养基的选用 将工程菌接种于４种发酵培养基中进行发酵，比较诱导表达结果及收菌量，选取合适的发酵用培养基． 2.基因工程药物的生产 2.1 基因工程菌的培养与发酵 3)接种量对发酵的影响 以10％或15％接种量较适宜． 4)溶解氧水平对发酵的影响 5)pH对工程菌生长和表达的影响 前期培养着重工程菌的生长：pH6.8-7.4 后期培养着重外源蛋白的表达：pH6.0-6.5 6)热诱导对表达量的影响 热诱导表达的工程菌一般在菌体的对数生长期或对数生长后期，在2min内温度突然升高10℃ 以上。 7)高密度对表达量的影响 高表达的前提下，适当提高菌体密度。 高水平溶解氧(40％)有利于外源蛋白的形成. (2)IFN-α2b基因工程菌的培养与发酵 　工程菌株:SW-IFNα2b/DH5α 　工程菌的种子培养:将工程菌接种在LB培养基中， 30℃振摇培养10h. 　工程菌的发酵:接入种子培养液至发酵罐中，30℃ 　　　发酵８h，然后在42℃诱导２h完成发酵。 2.2 基因工程药物的分离纯化 (1)影响分离纯化的主要因素 产物活性、纯度和杂质 产物表达形式和表达水平 产物本身的分子特性 产物的用途和需求量 (2)各种表达形式的分离纯化方法 包涵体的分离纯化方法 A. 菌体细胞的收集与破碎： 　 采用物理、化学和酶学三种方法进行破碎 B. 包涵体的分离、洗涤与溶解： 　 通过离心分离；TE缓冲液反复洗涤；　　　　 用尿素、盐酸胍、SDS等溶解. C. 变性蛋白质的纯化： 　 采用的方法有凝胶过滤、离子交换层析和 　 高效液相色谱等。 D. 重组蛋白质的复性： 　 适当条件使其重新折叠。 例：rGM-CSF的分离纯化 3.1 基因工程药物的质量控制 (1)与传统药品生产的区别 利用活细胞作为表达系统，产品为蛋白质，具有复杂的分子结构． 产品的制备过程中，药物容易发生变化． 参与人体的生理调节作用，极微量就可产生显著效应，在性质或剂量上不能有任何偏差