第六章 目的基因导入受体细胞.pptVIP

6.1 受体细胞 6.3.1遗传表型直接筛选法 DNA颗粒载体的制备 利用CaCl2对DNA的沉淀作用，以及亚精胺、聚乙二醇具有的粘附作用进行的。将这些化合物与DNA混合后再与钨粉或金粉混合，吹干后，DNA就沉淀在载体颗粒上。制备好的DNA颗粒载体，可在冰浴中存放，数小时以内有效。 高压放电—驱动力 高压气体—动力 优点： 基因枪法快速简单，可直接处理植物组织，接触面积大，并有较高的转化率。此法也可用于动物细胞的转化，甚至可以转化叶绿体和线粒体，但对微生物的转化效果较差。 6）脂质体介导法 脂质体（liposome）是根据生物膜的结构功能特性合成的人工膜，然后把DNA包埋在人工膜内。 脂质体是由磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸等脂质构成双层膜囊，它可分为三种结构类型，即小型单一双层膜囊型（SUV）、大型单一双层膜囊型（LUV）和复合双层膜囊型（MLV）。 主要： Ca2+-EDTA螯合法 反相蒸发法。 DNA liposome complexes Liposomes liposome nucleus DNA endocytosis complex membrane fusion Liposome-mediated Gene Transfer 7）超声波介导法 超过能听到的声波范围（50～2×104次/秒）的声波称为超声波。一般认为超声波的生物学效应主要是机械作用、热化作用及空化作用。 8)花粉管通道法 原理是授粉后使外源DNA沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。 操作： 柱头涂抹法 — 未授粉前，先用DNA导入液涂抹柱头，然后人工授 粉，迅速套袋。 柱头切除法 — 当受体植物自花授粉一定时间后（2～3h），切去花 柱，将DNA导入液滴于切口，迅速套袋，1h后复滴一 次。 花粉粒吸入法—对受体植物的花提前去雄套袋隔离，先用DNA导入液 浸泡授粉用的花粉粒，使外源DNA吸入花粉粒，然后 人工授粉，套袋。 Transgenic tobacco harboring a GFP Gene Bt transformed cotton Untransformed cotton 6.2.4.2 重组DNA分子导入哺乳动物细胞 病毒颗粒转导法 磷酸钙转染法 DEAE-葡聚糖转染法 DMSO（二甲基亚砜）转染法 脂质体介导法 显微注射 基因打靶 电穿孔 各种不同的转化方法 ① 病毒颗粒转导法 用包装好的重组病毒直接感染受体动物细胞。 此法须注意病毒与宿主的对应关系。 ② 磷酸钙共沉淀法 此法的依据是哺乳动物细胞能捕获粘附在细 胞表面的DNA－磷酸钙沉淀物，使DNA进入细胞。 Transformation for mammalian animals a.磷酸钙沉淀法:Ca2+促进 哺乳动物细胞吸收外源DNA b.共转化：将过量的媒介DNA与带有tk基因的重组DNA 混 合，用Ca2+沉淀转化细胞。 c.微量注射：一台仪器每小时注射500-1000个细胞，约 50%的细胞能稳定地整合并表达，任何DNA都可 注射到任何细胞中，效率高，不需筛选压力， 但需要昂贵的仪器，技术复杂，难以掌握。 Helper DNA Vector DNA Engineering a Virus into a Vector Wild type virus Viral vector Based on Kay et al 2001 replication proteins structural proteins Packaging Therapeutic gene essential viral genes Packaging cell Y vector Vector un-coating Therapeutic mRNA and protein Episomal vector Integrated expression cassette Target cell Gene Transfer Based on Kay et al 2001 ③ DEAE-葡聚糖法 DEAE-葡聚糖是一种高分