Westernblot所需溶液的配制.docVIP

WB所需溶液的配制 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 (Running buffer) 5× Tris base 15.14 Glycine(甘氨酸) 72.0 SDS 5.0 蒸馏水 溶解至1000ml 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。 转膜缓冲液 （Sending buffer）（现用现配） 1000 ml 1500 ml Glycine(甘氨酸) 14.413 g 21.6 1.0 M Tris.HCl (pH8.3) 25 ml 37.5ml 10% SDS 1 ml 1.5 ml 甲醇 (methanol) 200 ml 300 ml 蒸馏水 溶解至1000 ml 溶解至1500 ml 必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。小片段可不加SDS。 10% SDS配置 电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate ，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。 Tris.HCl的配置 1.0M Tris.HCl (pH8.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中 浓盐酸调pH到8.8 1.5 M Tris.HCl (pH8.8) Tris 45.43 g 加入到250ml水中 浓盐酸调pH到8.8 1.0 M Tris.HCl (pH6.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中 浓盐酸调pH到6.8 1.0 M Tris.HCl (pH8.3) Tris 30.28 g 加入到250ml水中 浓盐酸调pH到8.3，需要大约8毫升。 注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。 5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置 称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。 6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置 NaCl 80 g 160 g Tris base 24 g 48 g 双蒸水 溶解至1000 ml 溶解至2000 ml 加HCl调pH到7.6，室温储存。 TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置 10×TBS 100 ml 200 ml Tween20 1 ml 2 ml 双蒸水 溶解至1000 ml 溶解至2000 ml 室温储存。 8 上样缓冲液（loading buffer）的配置 SDS加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。 9 stacking gel buffer (4×) Tris base: 0.5M 5 ml 1M Tris.HCl SDS(w/v): 0.4% 0.4ml 1%SDS 调pH到6.8，加双蒸水到10毫升。 10 5×Sample buffer (10ml) Stacking gel buffer 5 ml SDS 1.0 g 巯基乙醇 2.5 ml（最后再加） 甘油（glycerol） 2.5 ml 溴芬兰（Sigma B-8026） 2.5 mg 室温储存 封闭液的配置 Blocking solution 要用TBST配制牛奶 5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA 0.01% antifoam A (Sigma) 0.01%(v/v) sodium azide 丽春红溶液： 100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。 4%多聚甲醛（PFA）的配制 （1000毫升） 40克多聚甲醛，加入800毫升水，60度搅拌溶解，加入300微升氢氧化钠，全部溶解后冷却到4度，再加入100毫升的10×PBS，加水定容到1000毫升。调pH到7.2-7.4。通风橱过滤，4度保存。 13 组织裂解液 10mM Tris- HCl (pH 7.4) 48.44mg 粉末或1M Tris- HCl 0.4ml 150mM NaCl 350.6 mg 1% TritonX-100 0.