十七抽提酯化条件对微藻脂肪酸组成和含量测定的影响.PPT

实验五 抽提酯化条件对微藻脂肪酸组成和含量测定的影响 一、目的要求 1、研究超声破碎、酯化及程序升温等条件对藻类脂肪酸组成和含量测定的影响 2、确定微藻脂肪酸抽提－甲酯一步法的最佳测条件 二、实验思路 本实验欲在实验十二“气相色谱法测定海洋微藻中的脂肪酸”的基础上，进一步研究该实验采用超声破碎、HCl－CH3OH溶液抽提酯化脂肪酸的预处理样品方法的最佳条件。因超声破碎、HCl－CH3OH溶液的酸度、酯化时间和反应温度均对不饱和脂肪酸中的烯键有破坏作用，实验中若这些条件选择不当，完全可能造成样品总方针组成和含量的改变。 三、仪器设备与试剂 1、仪器 （1）气相色谱仪（共用） 型号：Agilent 6890； 色谱柱：HP-5弹性石英毛细管，长30m，内径0.32 mm； 检测器：FID； 进样系统：带8盘位自动进样器； 自动进样针：10μL （2）氮气、氢气和空气发生器（共用） （3）超声波清洗仪（共用） （4）水浴锅（共用） （5）普通氮气钢瓶（共用） （6）自动移液管（0.5、1.0和2mL）3支（共用） （7）聚四氟乙烯材料若干 （8）10mL水解管 1支 （9）1.5mL进样瓶 1个 （10）尖嘴吸管 1 支 试剂 （1）内标：0.2mg/mL C19:0 （2）正己烷：色谱纯 （3） 小球藻藻粉：约10mg （4）1mol/L HCL(GR)－CH3OH(色谱纯)溶液：HCL:CH3OH体积比＝1:11 三、实验内容 1、超声破碎对脂肪酸组成和含量测定的影响 分别取高速离心（5000rpm/min）的冷冻干燥藻体2份（约10mg），置于10mL水解管，加入0.3mL 0.2mg/mL的C19:0内标，用氮气吹干后，加入2mL 1mol/L 的HCl－CH3OH溶液，充氮气１min后用聚四氟乙烯材料密封管口，旋紧螺帽。其中1个水解管置于超声清洗仪中低功率档超声破碎5min后在100℃水浴中反应40min，另1个水解管直接在100℃水浴中反应40min，两水解管冷却后用1mL正己烷萃取（振摇水解管1min），静置分层后用尖嘴吸管移取上层有机相（注意不要吸到水相）于1.5mL进样瓶中，用氮气吹至约0.5mL。再取1mL正己烷重复前述萃取、移相、吹气步骤一次后，将样品直接进行GC测定或密封后冰冻贮存待测。 2、酯化时间对脂肪酸组成和含量测定的影响 分别取3份冷冻干燥藻粉（约10mg），置于10mL水解管，加入0.3mL 0.2mg/mL的C19:0内标，用氮气吹干后，加入2mL 1mol/L 的HCl－CH3OH溶液，充氮气１min封口，置超声清洗仪中低功率档超声破碎5min后，在100℃水浴中分别反应20、30和40min，余下步骤与实验内容1同。 3、HCl－CH3OH酯化溶液酸度对脂肪酸组成和含量测定的影响 分别取3份冷冻干燥藻粉（约10mg），置于10mL水解管，加入0.3mL 0.2mg/mL的C19:0内标，用氮气吹干后，分别加入2mL 1mol/L、2mol/L和3mol/L 的HCl－CH3OH溶液，充氮气１min封口，余下步骤与实验内容1同。 4、水浴温度对脂肪酸组成和含量测定的影响 分别取3份冷冻干燥藻粉（约10mg），置于10mL水解管，加入0.3mL 0.2mg/mL的C19:0内标，用氮气吹干后，加入2mL 1mol/L 的HCl－CH3OH溶液，充氮气１min封口，置超声清洗仪中低功率档超声破碎5min后，分别在60℃、80℃和100℃水浴中反应40min，余下步骤与实验内容1同。 5、程序升温对脂肪酸组成和含量测定的影响 取一份已甲酯化的样品在色谱仪自行设计和改变升温程序，测定不同升温程序下的色谱图。 6、根据上述实验条件的结果，确定一套最佳流程。 四、实验要求 1、本实验可根据需要将学生分若干组，每组同时做上述不同的实验内容。也可分几次同时做一样的实验内容。也可任选其中之一内容进行。或者上述实验条件可由学生自行设计。 2、根据实验结果，比较各种条件对脂肪酸组成和含量测定的影响，确定最佳条件和流程。 * *