rDNAITS序列分析鉴定皮肤癣菌的应用评价-南京医科大学.PDF

南京医科大学学报（自然科学版） 第38卷第11期 ·1648· ACTAUNIVERSITATISMEDICINALISNANJING（NaturalScience） 2018年11月 rDNA⁃ITS序列分析鉴定皮肤癣菌的应用评价 1* 2 1 1 夏继宁 ，张能华 ，范建国 ，项 晶 1 2 嘉兴市中医医院皮肤科，检验科，浙江 嘉兴 314001 ［摘 要］ 目的：探讨对核糖体RNA（ribosomalRNA，rDNA）内转录间隔区（internaltranscribedspace，ITS）的基因扩增测序技 术在皮肤癣菌鉴定中的应用价值。方法：从39株临床收集的皮肤癣菌临床标本和经培养后的标本中分别提取DNA，应用通用 引物ITS1和ITS4进行PCR扩增和基因测序，测序结果在NCBI的基因库中查询，通过BLAST工具比对分析进行rDNA⁃ITS序列 分析分子鉴定。同时根据形态特征、生长特性以及生理生化指标对经培养后的标本进行表型鉴定，并与分子鉴定结果相比较。 结果：两组标本均成功扩增到ITS靶基因，经测序分析，临床标本和经培养后标本rDNA⁃ITS序列分析结果一致，与表型鉴定结果 相吻合。结论：直接从临床标本中提取致病菌DNA并进行ITS基因序列扩增和测序分析可快速、有效鉴定皮肤癣菌。 ［关键词］ 皮肤癣菌；内转录间隔区；菌种鉴定 ［中图分类号］ R692 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007⁃4368（2018）11⁃1648⁃03 doi：10.7655/NYDXBN 浅部真菌病的主要致病菌种为皮肤癣菌。鉴 1.2 方法 定皮肤癣菌的方法通常为观察菌落及镜下形态学 1.2.1 分离培养 特征、生长特性以及生理生化指标。随着科技进步 临床标本接种于SDA培养基，25℃培养1~2周。 及临床需求的提高，真菌分型、鉴定研究逐步引入 1.2.2 表型鉴定 分子生物学。本研究以皮肤癣菌临床标本和经培 根据形态特征、生长特性以及生理生化指标进 养后的标本为研究对象，分别对其进行表型鉴定和 行表型鉴定。诊断标准参考《医学真菌学——实验室 ［1］ ［2］ 核糖体RNA（ribosomalRNA，rDNA）内转录间隔区 检验指南》和《临床常见皮肤癣菌的特征和鉴定》。 （internaltranscribedspace，ITS）序列分析分子鉴定， 1.2.3 分子生物学鉴定 评价其应用价值。 选取临床标本和经SDA培养基上25℃培养1周 的菌落标本，按照说明书使用Ezup柱式真菌基因 1 材料和方法 组DNA抽提试剂盒分别提取基因组DNA。采用通 1.1 材料 用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。ITS15′⁃TCCG⁃ 收集嘉兴市中医医院皮肤科门诊2015年6月 TAGGTGAACCTGCGG⁃3′；ITS4 5′⁃TCCTCCGCT⁃ —2017年10月皮肤癣菌临床株共39株，取材前先 TATTGATATGC⁃3′。反应体系的制备：2.5mmol/L 用75％乙醇局部消毒，刮取体癣、股癣、手足癣患者 dNTPs4 μL，10×buffer5μL，10mmol/LMgCl 3μL， 2 的皮屑或甲癣的甲内侧碎屑，