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菠萝蛋白酶分离方法 菠萝蛋白酶简介 菠萝蛋白酶，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素。是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000，等电点为9.55。品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工，采用超滤方法进行过滤浓缩，低温冷冻干燥而得的。产品已被广泛应用于食品、医药等行业。 菠萝蛋白酶制备方法及比较 工业生产上对菠萝蛋白酶的制备主要是从菠萝的下脚料中提取，制备工艺有高岭土吸附法、单宁沉淀法、盐析法和超滤法等。 比较:高岭土吸附法获得的菠萝蛋白酶虽然纯度较高，酶活力在410×10 U／g以上，但工艺流程长，原料消耗多，酶活总回收率低，会对环境有污染； 单宁沉淀法比高岭土法简单，原料消耗少，酶活回收率较低，产品酶活力在315×10 －410×10 U／g，会对环境造成污染； 盐析法获得的菠萝蛋白酶活性较低，纯度与药用要求相差甚远 超滤法能有效分离提取菠萝蛋白酶。从超滤法提取菠萝蛋白酶的工艺流程上看，其操作步骤简单，并且该法具有无相变、低温、能耗少、活力损失小、操作简单等特点，应用于菠萝蛋白酶的浓缩和分离，不仅能保护其活性，降低生产成本，使用的有机溶剂可回收再生产，基本上没有废物排放，而且超滤透过液还可用作饮料添加剂，可以达到清洁生产的要求；另外，超滤法分离得到的菠萝蛋白酶质量好，纯度高，能达到医药级水平。 超滤法 超滤法提取菠萝蛋白酶的主要工艺操作包括： ①压榨。将菠萝下脚料洗净，用压榨机压出汁液，加入0.05 ％苯甲酸钠防腐，迅速过滤除杂质。可采用压滤法或离心法去杂质。 ②超滤浓缩。将澄清液在管式超滤设备中进行浓缩，使体积浓缩至原体积的1/5。 ③沉淀。将浓缩液降温至0~4 ℃，边搅拌边加入-20 ℃的95 ％乙醇，直至混合液中乙醇浓度为50％，静置，使酶沉淀，移出上清液，即得湿酶。 ④干燥。将湿酶在0 ℃下减压干燥或冷冻真空干燥即得菠萝蛋白酶精品。 工艺流程如图 所示。超滤法生产工艺和操作比较复杂，且设备一次性投资大。超滤浓缩后的浓缩液若再用高岭土吸附法或者单宁沉淀法提取，可大大节约其他辅助原料的用量，总生产成本减少，且产品质量好，纯度高，酶活力高，酶活总回收率高，经济效益明显比传统工艺好。超滤浓缩后的浓缩液用有机溶剂沉淀法提取精酶，由于需要低温使生产成本上升，但产品质量、纯度、酶活都优于前者，是菠萝蛋白酶升级换代的新工艺。 菠萝下脚米 汁液 澄清 液 浓缩液 湿酶 酶制品 超滤法提取菠萝蛋白酶工艺流程图 压榨 去杂质 超滤浓缩 降温，加有机溶剂、沉淀 减压干燥 单宁沉淀法 试剂：5％苯甲酸钠溶液； 单宁溶液； 0．1％EDTA溶液；0．5％EDTA溶液； 1．5％氯化钠溶液； 0．5％乙酸锌溶液； 0．06％抗坏血酸溶液； 0．5％硫代硫酸钠溶液； 1％L一半胱氨酸溶液。 实验步骤 菠萝蛋白酶的提取：称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以 4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。把洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％硫代硫酸钠溶液20 m1，搅匀，静止5 min；加1％L一半胱氨酸溶液10 ml，搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，最后得到蛋白酶糊。冷冻、干燥把提取的酶糊放入冰室中(一12℃)，低温冷冻15～20 h，取出解冻，离心得酶膏，把酶膏倒人装有氯化钙或五氧化二磷的干燥器中干燥6～10 h得干酶，研磨成