课件：限制性内切酶.ppt

限制性核酸内切酶 制作人：郜原 日 期：2010-3-31 简介 　　限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 　　[别名] Endodeoxyribonuclease 　　[酶反应] 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。 　　[单位定义] 在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。 定义和命名 DNA限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。 特征和种类 　　1．限制与修饰现象 　　 早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 　　E.coli 菌株 λ噬菌体感染率 　　lK lB lC 　　E.coli K 1 10-4 10-4 　　E.coli B 10-4 1 10-4 　　E.coli C 1 1 1 　　 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。 2.限制与修饰系统的种类　　根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。　　Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。Ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3- 羟基和 5- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。　　Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。　　Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。　　在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。 Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。如 EcoK 和 EcoB。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK 编码基因的结构为 R2M2S。 EcoB 编码基因的结构为 R