课件：基因工程32大肠杆菌克隆载体.ppt

3.3.4 用λ插入载体或置换载体进行克隆实验 用λ噬菌体载体进行克隆和用质粒载体相似： 限制性酶酶切载体，加入新的DNA，连接混合物，产物分子转染大肠杆菌。 这种实验需要把载体通过cos位点由氢键连接，以环状分子形式存在。 这种转染的方法在大多数情况下令人满意，但效率不高。 如果增加一两步操作，可以获得更多的重组体。 首先，要使用λ噬菌体载体的线状分子。 当线状分子被相应的酶酶切后，便形成了左右两个相互分离的片段。 连接被克隆的DNA和载体的左右两个片段，连接的结果可能有好几种不同的排列，其中包含一些由重复序列组成的连环体，重复的单位是：λ载体的左片段—被克隆的DNA—λ载体的右片段。 如果被插入的DNA是正确的大小，那么分隔这些重复序列的cos相隔正确的距离，能够用于体外包装。产生重组后的噬菌体可以感染大肠杆菌。用这种方法，经过体外包装，可以获得大量的重组分子。 3.3.5 用黏端质粒对大的DNA片段进行克隆 基于λ噬菌体的克隆载体中，最复杂的形式是黏端质粒。 黏端质粒是噬菌体DNA和大肠杆菌质粒两者的杂交体。 设计的基础： 把噬菌体DNA装进噬菌体头部的酶，仅仅只需要被包装的分子拥有cos位点就能够发挥作用。 在体外包装系统中除了λ基因组外，任何长度在37kb和52kb之间的DNA分子，只要两端含有cos位点，就能被包装进噬菌体头部。 黏端质粒基本上算是一个携带cos位点的质粒。 因为它缺少所有的λ噬菌体基因且不能产生噬菌斑，因此它需要有其他的筛选标记，如氨苄青霉素耐药性基因，也要有质粒复制起点。 采用黏端质粒的克隆实验步骤如下: 从单酶切位点切开黏端质粒; 加入新的DNA片段(这些片段通常是不完全酶切的产物，完全酶切后产生的片段对于黏端质粒来说太小了); 进行连接反应，形成连环体。 如果插入的DNA大小合适，体外包装系统从cos位点切开连环体，把重组后的黏端质粒包装进成熟的噬菌体颗粒。 用这些λ噬菌体去感染大肠杆菌，但不会产生噬菌斑，把感染后的大肠杆菌培养在选择性培养基平板上，只有那些有抗生素抗性的菌落才能生长。 所有的菌落都是重组体，因为那些没有重组的线性的黏端质粒太小，根本不可能被包装进噬菌体头部。 3.4 λ载体和其他高容量的载体使基因组文库得以建立 基于λ噬菌体的载体的主要用途是克隆那些不能被质粒或M13载体所操作的DNA大片段。 插入的外源DNA片段： M13载体：不超过3kb 质粒：不超过8kb 置换载体λEMBL4：达到20kb 某些黏端质粒：40kb。 这种可以克隆如此之大的DNA片段的能力，使得人们可以建立基因组文库。 基因组文库： 一套覆盖某个生物体所有DNA的重组体克隆。 例如，一个大肠杆菌的基因组文库，包含所有的大肠杆菌基因。 据此，可以抽提出任何我们所感兴趣的基因加以研究。基因组文库可以保存很多年，也可以很容易在研究组织间相互传播。 当要建立基因组文库时，面临一个重要的问题：一个基因组文库到底需要多少个克隆? 可以用下面的公式计算： N=ln(1-P)／ln(1-a／b) N指所需要的克隆的个数，P是得到所有基因的可能性，a是插入到载体中去的DNA片段的平均大小，b是基因组的大小。 从几十万个克隆中一个个筛选出感兴趣的基因是不明智的。 减少克隆数的方法： 方法一：开发能够携带更大DNA片段的克隆载体。 细菌人工染色体（BACs）： 基于F质粒构建的新载体。 F质粒相对较大，由它开发的载体有着比普通质粒载体大很多的容量。 BAC能够插入超过300kb的DNA片段，由此使人类基因组文库的克隆数下降到30 000个。 基于噬菌体P1发展而来的载体 P1优于λ的地方：能够在它的蛋白质外壳中挤进110kb的DNA。 基于噬菌体P1设计的黏端质粒可以用于克隆长度从75 kb到100kb的DNA。 还有一种载体，结合了P1载体和BAC的特点，称为由P1衍生的人工染色体(P1-derived artificial chromosome，PAC)，同样也拥有超过300kb的容量。 3.5 其他细菌的克隆载体 人们还开发了为其他一些细菌服务的载体。 这些载体中， 有的只对特定宿主有效的质粒载体； 有的是能够在许多宿主中复制的广谱宿主质粒； 还有少数几个是从噬菌体开发出来的克隆载体。 大多数这些载体的性质和用法都和大肠杆菌的载体很相似。 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方