课件：微生物肺炎克雷伯.ppt

* * 标本：尿 培养基：血平板、MAC（EMB、SS、XLD） KIA、MIU、葡萄糖蛋白胨水、 枸橼酸盐培养基、 鸟氨酸脱羧酶培养基及对照管 试剂：革兰染液、荚膜染液、V-P试剂、吲哚试剂、95%乙醇溶液 器材：孵育箱、接种环、酒精灯、显微镜 基本特性 直接涂片，镜下观察。 接种：在镜下观察细菌的大致形态及其数量，直接将标本用接种环蘸取后接种在血平板、MAC（EMB、SS、XLD）上，进行培养。 温育：37 ℃ 孵育18-24小时。 观察菌落形态：血平板上形成圆形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌落，相邻菌落易于融合，粘液状，若用接种针蘸取呈长丝状拽起；MAC上形成乳糖发酵产酸的菌落，即红色或粉红色、较大、浑浊、凸起、有光泽的粘液型菌落（EMB上是大、粘稠、红色、易溶于一片的菌落，SS上是红色或粉红色、或具有粉红中心的无色菌落，XLD上呈不透明黄色的菌落）。 制片 1.载玻片准备：玻片先在95％乙醇中去除油污，再在火焰上烧去粘附的乙醇，待冷，做好标记。 2.涂片：在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水（或用接种环挑1-2滴水），用无菌的接种环挑取少量菌种与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，涂布面积约1cm2??。 3.干燥：涂片在室温下使其自然干燥，也可以小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。? ? 4.固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火三次（手指触摸反面不烫手为宜），待玻片冷却后再进行染色。 革兰染色：挑取可疑菌落涂在干净的玻片上自然晾干，用结晶紫（1液）覆盖细菌初染1min，清水冲洗干净玻片再滴加革兰染液（2液）媒染1min，清水冲去表面的染液，用95﹪乙醇（3液）脱洗约30s（以乙醇不再有颜色为好），最后用稀释的复红（4液）复染30s。自然晾干后在显微镜下观察形态。 荚膜染色 1.染色：玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）草酸铵结晶紫（或石炭酸复红染液）于菌膜部位，染色1-2min。 2.水洗：斜置载玻片，在自来水龙头（或洗瓶）下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ??? 3.干燥：自然干燥或用吸水纸吸去涂片上的水，用吸水纸时切勿将菌体擦掉。 4.镜检：用高倍镜和油镜观察并绘细菌形态并绘图于记录表中。 镜下形态：G-杆菌，卵圆形或球杆状细菌，长成双排列，有荚膜，无鞭毛。（如有需要，可进行荚膜染色，染色后菌体呈卵圆形或球杆状，成双排列，菌体外绕以明显的荚膜长较菌体宽2-3倍。） 生化鉴别 定科：氧化酶试验（-）、IMViC（- - ++） 定属：KIA（AA+ -）、MIU（- - +）、 O/F（F）、鸟氨酸脱羧酶试验（-） 定种：吲哚（-） 编码鉴定 血清学鉴定 氧化酶试验：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C将盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺氧化成红色或蓝色的醌类化合物。主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。 back I（吲哚）：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，与对甲基氨基苯甲醛结合，生成红色化合物玫瑰吲哚。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。 M（甲基红）：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，不再继续分解，故培养基pH在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈紫红色（阳性）。有些细菌将分解葡萄糖产生的酸进一步转化为醇酮等非酸性物质，使培养基pH在6.2以上，加入甲基红试剂成橘黄色（阴性）。一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。 Vi：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸可进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。若培养基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酸肌酐，可加速其反应。一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。 C（枸橼酸盐）枸橼酸盐培养基中不含任何糖类，枸橼酸盐为唯一碳源，磷酸二氢铵为唯一氮源。如果细菌能利用铵盐作为唯一氮源，并能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，在枸橼酸盐培养基上生长，并分解枸橼酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，为枸橼酸盐利用实验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐为碳源，则细菌不能生长，培养基不变色。 back KIA（克氏双糖铁）克氏双糖铁斜面培养基，用酚红作指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色，培养基中的葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的1/10，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，分