课件：核医学放射性标记化合物.ppt

* 2、乳过氧化物酶法： 乳过氧化物酶有促进微量过氧化氢对125I-的氧化作用生成125I2，并标记在蛋白质酪氨酸分子上。本法应该注意：反应条件温和，H2O2只需要极低浓度（1×10-3 mM）因而通常能保持标记化合物原有的生物活性和免疫活性。 缺点：标记率低，20-40% * 3、联接标记法： 先用Na125I和氧化剂（CH-T）碘化 酰化剂3-(对-羟基苯)丙酸-N琥珀亚胺酯（Bolton-Hunter试剂或BH） 再与蛋白质分子中的游离氨基酸相结合引入蛋白质中。 * 优点： ①避免蛋白质与氧化剂的接触； ②避免蛋白质与放射性碘的直接接触； ③防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤； ④适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后会引起蛋白质的失活。 缺点：操作麻烦，二步反应，引入异物，放射性碘利用率受一定影响。 * 4、固相氧化法（ Iodogen） Iodogen 在一定PH及温度范围内使用，在水中溶解度极小。 将Iodogen的二氯甲烷溶液放入反应管中或涂在小破片上，微微加热，使溶剂挥发后，反应管下部或小玻片上就形成Iodogen薄膜，蛋白质碘标记反应就在反应管中进行，或将小波片“悬挂”入加有Na125I的细胞培养液中，可使细胞表面的蛋白碘化。 优点：碘化效率高，对标记物的损伤程度小。 5、核酸碘标记： 即探针，原理同上。 举例：DNA的125I标记技术。操作程序 ①DNA常规提取纯化； ②DNA加热（70℃），分为单股DNA； ③用TLCL3将Na125I氧化产生125I2 ④调PH4.7，125I将取代嘧啶环上第5位的碳原子，形成共价结合的DNA单链。 ⑤降温，恢复双股DNA得125I-DNA； ⑥纯化。 * 6、32P、35P、33P的标记： 这三核素主要用于标记核苷酸，而标记蛋白常用125I、3H。 * 五、放射性标记化合物的纯化与鉴定 （一）标记做完后需做三件事： 1、标记率测定 2、分离纯化； 3、产品质量鉴定； （二）标记率：放射性核素标到标记物的量占投料总放射性的百分数。 常用测定方法： 1、纸层析法：混合样品中各组分的性质不同，在固定相上的吸附能力和在流动相中的溶解度不同，因此它们各自的移动速度不同，可在特殊纸片上分离开。 常用：比移值Rf表示各组分的移动速度快慢。 意义：某标记物的Rf值在相同条件下稳定不变。纸层析（薄板）层析示意图见P90。标记率图见P91 Rf = 待测组分到原点的距离I 流动相前沿到原点距离L * 2、薄层层析 原理 硅胶或氧化铝（固定相）：根据混合物各组分的吸附力和分配系数不同而分开。 离子交换树脂（固定相）：根据各组分离子电荷的性质和数量不同而分开。 聚酰胺：以各组分氢键吸附能力不同而分开。 展开实验注意问题 ⑴层析纸长度，一般20cm左右，越长分离越好； ⑵展开剂要精心设计，选2-3种进行验证。要求：能把 混合物很好的分开，用时还要组成简单，粘度小，展开 快，展开后易挥发，价格低，易购买。 ⑶点样斑大小适当。 ⑷点样斑不能碰到展开剂的液体。 ⑸层析缸要有盖，减少干扰。 ⑹分段测量，段的大小要一致； ⑺起跑点所在段也要测量。 ⑻高比活度样品点要加载体，减少吸附。 * ⑼避免反复点样，层析纸要自然晾干； ⑽最好能用标准样品做对照。 ⑾各段剂量值必须减本底。 标记率计算：P90 （三）分离纯化（为什么）？？？ 纯化方法 凝胶过滤法—— 分离标记蛋白与无机碘 离子交换法——分离短肽标记物 透 析 法——分离标记蛋白与小分子 亲和层析法——特异性好,保持生物活性 ConA吸附法——糖蛋白 标记化合物主要质量指标（5个） 1，放射性核素纯度，2，放化纯度、3，放射性比活度、4，生物活性5，免疫活性及标记位置 放射性核素纯度及其检查 所需放射性核素的活度 放射性核素纯度（%）=------------------------- % 样品的总放射性活度 * （三） 放化纯度及鉴定： ? 特定化学形态的放射性活度 放化纯度 = ---------------------------- % 样品总放射性活度 放化纯度的测定原则： 高效的化学分离与灵敏的放射性测量