课件：组化3第三章酶组化.ppt

根据ATP酶对激活剂、抑制剂的不同反应，以及超微定位观察，生物体内主要有三种三磷酸腺苷酶（ATPase）。 1、膜ATP酶：又分为Na+、K+激活 ATPase 和Mg2+激活ATPase； 2、肌球蛋白ATP酶：又称Ca2+激活 ATPase，因为它可被Ca2+激活； 3、线粒体ATP酶：由Mg2+激活的ATPase （三）光镜显示方法 1、Mg2+激活的三磷酸腺苷酶铅法 （1）原理：ATP酶分解ATP释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，通过形成硫化铅沉淀显色。最适pＨ值为7.2。 （2）孵育液的配制： 三磷酸腺苷钠盐 5mg 0.2M Tris-盐酸（Tris-HCl buffer） 4ml 2%Pb(N03)2 0.6ml 0.1M MgSO4 1ml 蒸馏水 4.4ml 配制时Pb(N03)2 要逐滴加入，并随时搅拌，使充分混合至无色或淡乳白色。 （1）方法与步骤： ① 新鲜组织,冰切片； ② 入孵育液，恒温37℃孵育20~40分钟 ③ 蒸馏水洗； ④入1%硫化胺1分钟; ⑤流水洗； ⑥甘油明胶封固。 (4)结果: 酶活性处呈棕黑色硫化铅沉淀。 (5)对照: ①除去底物，则反应为阴性；②以?－甘油磷酸钠代替底物，显示染色反应为碱性磷酸酶的定位。 2、Ca2+激活的三磷酸腺苷酸 钙-钴法（肌球蛋白型ATPase Padykula和Herman 1995） （1）原理：此法类似碱性磷酸酶的钙-钴法，但底物改用三磷酸腺苷钠盐，最适pＨ值为9.0，对Mg2+型ATPase起抑制作用。 （2）孵育液的配制： 三磷酸腺苷钠盐 60mg 0.1M巴比妥钠 4ml 蒸馏水 2ml 0.18M CaCl2 2ml 2,4－二硝基苯酚 30mg （1）方法与步骤： ① 新鲜组织,冰冻切片； ② 入孵育液，恒温37℃孵育20~40分钟 ③ 蒸馏水洗； ④ 1％CaCl2溶液换洗三次，每次2分钟 ⑤ 蒸馏水洗； ⑥ 入CoCl2液5分钟; ⑦ 流水洗； ⑧ 入硫化胺液1分钟； ⑨ 流水洗； ⑩甘油明胶封固。 (4)结果与评价: 硫化钴黑色沉淀为酶活性所在部位。 (5)对照: 同铅法，可除去底物或用?－甘油磷酸钠作底物。 六、非特异性酯酶 （一）名称 常用名： 非特异性酯酶Nonspecific esterase） (二) 反应原理 随各种方法的不同，其原理不相同。 （三）、光镜显示方法 1、偶氮色素法（偶联偶氮色素法） 由于使用不同的重氮盐，具体方法也不相同，现分述如下： (1)??萘酚AS乙酸盐（Naphthol AS acetate）法 1）孵育液的配制： 1％萘酚AS乙酸盐（丙酮溶液） 0.1ml 0.05磷酸缓冲液（pH 7.0） 10ml 坚牢蓝B盐