细胞凋命亡及其检测方法.ppt

* * * * 这两种方法用于检测组织或培养细胞的凋亡细胞的核断裂片段，可以检测早期的细胞凋亡，且特异性和敏感性都是较高的，就其敏感性而言，TUNE鉴定高于INST鉴定。值得注意的是，就ISEL技术本身而言，是不能区别凋亡、坏死和自溶性死亡，必须结合凋亡细胞的形态学特征加以判断。TUNEL和ISNT鉴定标记的阳性细胞可结合下列标准加以判断：显示单个或少数几个细胞孤立地分布在组织中；具有凋亡细胞的核特征，即核固缩，表现为一个或多个染色体团块，或者凋亡小体核片段；周围或局部无炎症反应的征象。 * * 根据标记在dUTP上的标记物和显示系统的不同，可分别作组织切片凋亡细胞的原位检测、培养细胞涂片和培养细胞的流式细胞仪检测、培养细胞涂片和培养细胞的流式细胞仪检测。 * * * * DNA断链可是单股断链也可是双股断链，两种断链都有游离的3’-羟基末端，因此，TUNEL鉴定可以检测凋亡细胞核中的单股和双股DNA断链。用于组织切片和凋亡培养的检测，其敏感性较ISNT要高。 * * * 时间要得当消化时间太长，非特异性染色增多，使一些非凋亡细胞着染，同时将破坏细胞形态，细胞复染时着色浅，背景也不清晰。而消化时间太短，细胞膜达不到应有的通透性，影响标记效果。 * 主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等。其中细胞核的改变最具特征性。 由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料(fluorochromes)对凋亡细胞DNA可染性（DNA stainability）发生改变。目前倾向认为凋亡细胞DNA可染性的降低主要与DNA从这些细胞中部分丢失（由于内源性核酸酶的激活）即低分子量DNA产物从细胞中发生弥散出去有关。 在坏死细胞中，DNA的可染性并不立即下降，甚至还会增加。可能是由于细胞坏死时DNA的部分变性而引起更多的结合位点暴露所致。 流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活(viable)”细胞和“死(dead)”细胞，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞； 凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散身光降低。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核碎裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大。 但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。 * 在作流式细胞仪分析时，Heochst33342用氪激光(krypton laser)激发的紫外线荧光，激发光波波长为 352nm，发射光波波长为400~500nm，产生蓝色荧光：PI用氩离子激光(argon-ion laser)激发荧光，激发光波波长488nm，发射光波波长大于是630nm，产生红色荧光。 Heochst类染料(特别是Heochst33342)可以少量地通过正常细胞的细胞膜而对细胞很少有细胞毒作用，这使之在非固定的凋亡细胞的检测中特别有用。Heochst33342是双苯并咪唑(bis-benzimidazole)家庭中的成员之一，能特异性地与DNA螺旋小沟(minor-groove)的富含AT重复序列结合。Heochst33342能被活细胞摄取，摄取率依细胞的类型而不同。而其从细胞内排出，是一个耗能的主动过程，依赖于细胞膜上的p-糖蛋白泵。其他染料如碘化丙啶（PI）、溴化乙啶（EB）和7-AAD，活细胞对这些染料是有拒染性的，当细胞被这些染料着染，提示凋亡细胞已到了较后期的阶段抑或细胞已经坏死。 * * Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。 * TUNEL比ISNT要更敏感，TUNEL中，b-dUTP渗入凋亡细胞中较快，30min就有很强的信号，而ISNT要几个小时才能达到最大标记效果。 * * DNA断链发生在细胞凋亡的早期阶段，先于其形态学上的改变。因此，TUNEL或ISNT的流式细胞仪分析可以在凋亡的早期阶段细胞还没有出现形态学改变时检测出细胞凋亡，可用于研究凋亡的早期事件； * * * * * * 1885年Flemming观察到退行性卵泡上皮细胞的染色质聚集成半月状或固缩成小体状，Nissen于次年在浦乳期乳腺中观察到类似改变，然而这些描述并没有引起学术界的注意。19