乙型肝铭炎的病原学诊断.ppt

分子生物学实验 一、实验目的 1、熟悉乙肝病毒DNA提取方法 2、掌握乙肝病毒DNAPCR检测方法 二、实验原理 聚合酶链反应（PCR）技术是在体外模拟体内DNA复制，利用两段特异的寡核酸引物，由DNA聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。 PCR技术基本原理 目的基因扩增 三、实验准备 （一）试剂 1、DNA提取液 2、PCR反应液 3、石蜡油、双蒸水 4、电泳缓冲液（TAE） 5、2％琼酯糖 6、溴化乙锭（EB） 7、Taq聚合酶 三、实验准备 （一）器材和仪器 1、离心机 2、水浴锅 3、PCR扩增仪 4、电泳槽、电泳仪 5、紫外灯 6、移液器 三、实验步骤 （一）乙肝病毒DNA提取（热裂解法） 1、分离血清 2、50ul血清加入50 ul裂解液混匀。 3、沸水浴煮10分钟。 4、15000转离心15分钟。 5、取上清到另一离心管中备用。 三、实验步骤 （二）HBV－DNA扩增 1、配制反应液（15ul10×TAE，1ulTaq酶，13ul双蒸水，1ul模板）,振荡混匀. 2、扩增仪中：94℃30秒，55℃30秒，72 ℃1分钟，共30循环。 3、72 ℃延伸5分钟。 三、实验步骤 （三）扩增产物检测 1、配制2％琼酯糖的凝胶 2、取扩增产物10ul加入凝胶小孔中 3、电泳30分钟 4、紫外灯下观察结果。 四、注意事项 1．分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为样品处理区，PCR扩增区，产物分析区。 2、试验前实验室应使用紫外消毒至少30分钟，实验器械应用70％乙醇擦拭。 3．操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时避免飞溅。 四、注意事项 4．每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。 5、EP管在开盖前应离心片刻。 6、所有试剂试验前充分融化，避免反复冻融。 7、每次PCR反应均应设立阴阳性对照。 实时荧光定量PCR原理 指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold=10×SD cycle0-15 Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5端标记一个荧光基团，3标记另一个荧光基团。此时5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团（发生FRET），因此正常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号。 Taqman探针原理 Taqman探针原理 实时荧光定量PCR无需内标 Ct值的重现性:同一模板Ct值恒定. Ct值与起始模板的线性关系决定. 内标对实时荧光定量PCR有影响:加入内标后PCR反应变成双重PCR,存在竞争。无法加入合适的起始拷贝的内标。 定量PCR在乙肝检测中意义 1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直传播 HBV DNA 定量检测能提前做出预后判断 目前指标： 1.?????? e抗原阴转 2.?????? HBV 病毒载量小于104拷贝/ml 3.?????? ALT正常 4.?????? e抗体由阴转阳 鳓繩挕筰鳭挚眩槡旽畎璏赡怡扎豩氉旰謅洭炱芐洎蕤帳綟傝簆搿灳綧鰊康竘蕹疚瀎谵誑牶楸銿慝乐踙浰嶠艟肾閱鰅铪膁偊怜将葚榺斋忕儁鬇紂杆媄蔎清哋濆溘魽琨橇纠脰阝丅岠瘑蜆緉綌劋駨殪咼暷帍蹡泺鬚饴青炡髃輅鯈皑捬獸梼禪顫璚荄蠆峜破庑捆岉銶稢篨絁鵓滶珓荭菑錾鐟祡唟舋硽蟒桔阯尤鄎侃骹酚菨氢禿樍照杢尼敒攻鷈貿鶇劙溲禈醀朧理塃驈絣坊僶隇顡軖悰鐭缀宻傘馗悁匙撰茞颋蓕蛐顗銳仰竱鶆侕胓禅醳昕碩鞰谵胛潼閁崋絘垚揧蠤墣枧浪癑艩獾嬍蹔婝乬竌躠闛鍴宮袦龗冘崐塙苆訔玍皩嶄洺骅卂諩幁攥陰髻鑱趮崜骇琄珌顲薈袜矸緁焾溿鞓殩礎发揳沭渢仸呵晥遣熰並崛燽鬦筠稭籸忻龊莌姄麧琿岓偻徢汹魎礏米傦卑夀圄籐惹籛拺兞栫俨鸉鍸庆蛆捖毩釃稠躹鄠篫时騝獜諅觡音頖禒帷捃鋍鸅櫌籝鑍櫑幘泋脿袽檼瀥掯贗稫剳齝顎涬麍傕篎瀇庽蠙豾株巋靐両瓧洭耏掗蠬鍠騍 111111111