第三章 细五胞生物学研究方法.ppt

第三章  细胞生物学研究方法 第一节、细胞形态结构的观察方法 第二节、细胞组分的分析方法 第三节、细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、 光学显微镜技术（light microscopy） 二、电子显微镜技术 (Electro microscopy) 三、扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) 第二节 细胞组分的分析方法 离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞的培养 二、细胞工程 一、光学显微镜技术（light microscopy) 1、普通复式光学显微镜技术 2、荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 3、激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Confocal Microscopy） 4、暗视野显微镜（Dark Field Microscope） 5、相差显微镜（phase-contrast microscope） 6、微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） 7、录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 二、 电子显微镜技术 电子显微镜的基本知识 ?电镜与光镜的比较 ?电镜与光镜光路图比较 ?电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 ?超薄切片技术 ?负染色技术与金属投影 ?覆膜与冰冻蚀刻技术 ?电镜三维重构技术 扫描电镜 （Scanning electron microscope，SEM） 三、 扫描遂道显微镜 Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如 量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等， 并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。 特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察 用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。 利用扫描隧道电子显微镜观察到的DNA分子 普通复式光学显微镜技术 光镜样本制作 分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 荧光显微镜的原理 荧光显微镜的应用 ?直接荧光标记技术 ?间接免疫荧光标记技术 ?在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：绿色荧光蛋白 Green Fluorescence protein，GFP This photograph was made with white light with no exciter filter and no barrier filter. 利用GFP进行的蛋白质的基因工程化改造 直接荧光标记技术 利用直接荧光标记技术进行样品的观察，需要对样品进行荧光染色。标记荧光素的样品在荧光显微镜下经过不同波长的激发光激发后会发生不同颜色的荧光。 常用的荧光染料有以下几种： rhodamine，受到黄绿光激发后发红色荧光 Fluorescein，受到蓝光激发后发绿色荧光 Texas red，受到激发后发红色荧光 Cy3，受到激发后发橙色荧光 间接免疫荧光标记技术 由于直接荧光标记后样品产生的荧光强度较弱，同时无法特异性地显示细胞内生物大分子，因此在此基础上发展起了间接免疫荧光标记技术。通过荧光标记的抗体与细胞内特异分子的结合来显示这些生物大分子在细胞中的分布。 利用较短波长的光使样品受到激发产生较长波长的荧光，用来观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置，这种显微镜称为荧光显微镜。 根据激发光的路径不同，可将荧光显微镜分为透射式和落射式两种类型。 激光共焦扫描显微镜技术（La