免疫荧光标记实验中经常出现的问题.docxVIP

荧光标记后样品荧光强度低或失败的可能原因有： 1.样本因素： 1) 组织切片缺损、破碎、变形； 2) 组织切片过厚、薄； 3) 组织或细胞固定、保湿不当引起细胞皱缩变形； 4) 悬浮细胞在离心过程中离心转速太高、等渗液不当、刮除操作导致细胞膜破裂； 5) 细胞死亡、用力的吹打和振荡会使贴壁细胞变悬浮、变圆和丢失； 6) 细胞密度过高、过低； 7) 细胞不纯，夹杂其它细胞； 8) 细胞状态欠佳，例如，有一些探针只标记活细胞，如果细胞活性不够则难以标记上荧光； 9) 其它。 2.探针因素 1) 荧光探针失效。这是一种很常见的标记失败原因。荧光探针一般要低温保存、不要反复冻溶、应用液现用现配制，另外其要在保质期内使用； 2) 所用介质、pH值不适当。例如FITC：在pH6-8时，很难跨过完整的活细胞膜使之染色，但在，pH为9时，可以跨膜进入细胞； 3) 探针溶解不充分。虽然加入溶液的探针量足够，但探针没有完全溶解，因此，实际接触细胞的探针浓度很低； 4) 探针泄漏。例如，用可透细胞膜的探针FDA标记细胞后，应在40分钟内测定，否则其从进人开始，120分钟后，其荧光就只剩下约10％，细胞内的荧光探针会大部分泄漏到细胞外； 5) 探针选择错误。探针的化学形式直接影响标记的结果。例如标记活细胞ca2+，使用Fluo —3荧光探针时，其有两种形式，Fluo-3 AM和Fluo-3；直接与活细胞共孵育标记时，要用荧光探针的跨膜形式Fluo-3 AM，而不能用Fluo-3，后者可用显微注射等方式导入细胞。而Fura-2采用双波长检测（比率法），Fluo-3是单波长检测，Fura-2的激发波长是340nm和380nm，发射波长为510nm。Fluo-3的激发波长是506nm，最大发射波长为526nm。Fura-2可以采用流式细胞仪检测，Fluo-3一般采用激光管聚焦或荧光显微镜检测。 6) 荧光干扰。样品中的自发荧光光谱范围很宽，有时会干扰正常细胞染色，例如，叶绿素的自发荧光光谱范围很宽且强度高，会覆盖某些红、黄、绿色荧光。 7) 荧光重合，例如。FITC的荧光光谱和GFP的荧光光谱在有很大一部分是重合的，在荧光显微镜下很难分开。因此如果不具备分开二者光谱的仪器设备，应尽量避免二者同时出现在同一样品中； 8) 其它。 3.标记过程中的因素 1) 所使用的荧光探针浓度过低； 2) 标记条件不适当：孵育的时间、温度不当，大多数情况下都是样品与探针孵育温度太低或时间太短造成； 3) 观察样品荧光的条件不适宜。有时，虽然样品已经标记了荧光，但是如果观察样品所使用的条件不适宜，也会观察不到荧光。例如APC红标记的样品，其最大激发波长为650nm，用一般荧光显微镜很难看到；共聚焦显微镜激光谱线中用633nm的激光谱线才能采集到其图像； 4) 有淬灭剂存在。如果介质中含有淬灭剂，如卤素离子、重金属离子、具有氧化性的有机化合物(硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物和羟基化合物及氧分子等)，也会使荧光下降或完全淬灭； 5) 错加或漏加试剂、加入顺序错误等； 6) 探针孵育过程中环境因素（温度、避光）影响； 7) 漂洗不当：时间过短、过长，漂洗液（PBS）失效； 8) 其它。 4.检测过程因素： 1) 设备运行状态：设备老化、计算机操作硬件、操作系统和软件应用系统、激光输出能量衰减、激光光路偏移等； 2) 参数设置不对：Em、Ex、Speech、Object等； 3) 检测参数没有优化：Pinhol、PMT（Gain/Offset）、AOTF、Power、Av./Lin.等 4) 样本不在兴趣区； 5) 焦平面不在Confocal层面； 6) 其它。