2017年主管检验技师考试临床免疫学和免疫检验讲义第十二章固相膜免疫测定.docVIP

第 PAGE \* MERGEFORMAT 1 页 共 NUMPAGES \* MERGEFORMAT 3 页 · 第十二章　固相膜免疫测定 第一节　概述 　　固相膜免疫测定以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性、非共价键高度吸附抗体或抗原和易于漂洗等，固相膜像滤纸一样，可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行。标记物可用酶或各种有色微粒子，如彩色胶乳、胶体金或胶体硒等。　　　　一、常用的固相膜 　　固相膜免疫测定中常用的膜为硝酸纤维素（NC）膜以及玻璃纤维素（fiberglass）膜、尼龙（nylon）膜、聚偏氟乙烯（PVDF）膜等。　　　　二、固相膜的技术要求　　1.孔径：用于穿流法的膜一般选择0.4μm左右，用于横流法的膜可选择5～10μm。　　2.流速：以ml/（cm2·min）表示。孔径大，流速快。　　3.蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示。　　4.均一性：优质的膜应具有良好的均一性，这样才能保证试剂批内的均一性。 　　 第二节　免疫金标记技术 　　利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标志物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（IGSS）。 　　　　一、胶体金的制备 　　（一）制备原理：一般采用还原法，常用的还原剂有枸橼酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂，使金离子还原成金原子,形成金颗粒悬液，也称金溶胶。　　（二）技术要点：金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或免疫凝集试验的基础。　　（三）注意事项　　1.玻璃容器的清洁：玻璃表面污染会干扰胶体金颗粒的生成，用前经过强酸洗，后硅化。 　　2.试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其1%水溶液在4℃可稳定数月不变，实验用水一般用双蒸馏水，实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。 　　　　二、免疫金制备　　（一）制备原理：免疫金是指胶体金与抗原或抗体等大分子物质的结合物，在免疫组织化学技术中，习惯上称之为金探针。蛋白质被吸附到胶体金颗粒表面而结合的过程。　　（二）技术要点　　1.胶体金溶液的pH：原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。　　2.蛋白质最适标记量　　（三）注意事项　　多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：①为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；②为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。 　　 第三节　膜载体免疫测定的种类与原理 　　一、斑点免疫渗滤试验（IFA）　　用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标记物等，以及用于检测尿液HCG的“金标”早孕诊断试剂。　　（一）原理：将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，将膜贴于吸水材料上，依次在膜上滴加标本、免疫胶体金及洗涤液等试剂进行抗体或抗原反应，过量试剂很快渗入吸水材料中。　　抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。液体通过微孔滤膜时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达到快速检测的目的，同时洗涤液的渗入在短时间内即可达到彻底洗涤的目的，简化了操作步骤。 　　（二）方法类型　　1.双抗体夹心法测抗原：用抗体结合在微孔滤膜中央，滴加待检标本，抗原抗体反应后，滴加金标抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点。　　2.间接法测特异性抗体：用抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测标本，滴加洗涤液洗涤后，滴加金标抗抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点。该法由于血清标本中非目的IgG的干扰，易导致假阳性结果。　　（三）实验材料　　1.滴金反应板，为胶体金免疫渗滤试验中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的醋酸纤维素膜片三部分组成；　　2.胶体金标志物；　　3.洗涤液；　　4.抗原参照品或抗体阳性对照品。　　（四）技术要点 本方法实验操作非常简单，其操作要点为：　　1.将反应板平放于实验台面上，于小孔内滴加含待测抗原的标本1～2滴，待完全渗入，与膜上的抗体反应而结合在膜上。　　2.于小孔内滴加胶体金标记抗体试剂1～2滴，待完全渗入，使胶体金标记抗体与结合在膜上的抗原反应。　　3.于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入，洗去未结合的胶体金标记抗体。　　4.结果