第六章 免疫标记技术.ppt

（3）颗粒SPA的应用 协同凝集试验——颗粒SPA 吸附试验 SPA吸收IgG试验 标记SPA的应用 酶标SPA法 四、通用与放大技术 1 ．SPA通用系统 2．ABC放大系统 2．ABC放大系统 生物素-亲合素系统（biotin-avidin system-ELISA）的特点： 高度特异性和灵敏性、简单快速安全稳定 （1）生物素、亲合素、链霉亲合素的特性 （2）生物素、亲合素的标记技术 （3）生物素-亲合素系统的应用 （1）生物素、亲合素、链霉亲合素的特性 生物素（biotin，B）又称维生素H、辅酶R（羧基转化酶的辅酶） MW 244.31， pI 3.5 分子式为C10H16O3N2S 亲合素（avidin，A）： 又称卵白蛋白、抗生物素。 MW 68,000，pI 10～10.5， 为碱性蛋白，含糖量高达10% Ka = 1015mol/L 1个A与4个B结合 链霉亲合素（streptavidin，SA）：与亲合素类似，是由Streptomyces avidin菌分泌的一种蛋白质。 MW 65,000，pI 6.0，为略偏酸性的蛋白，SA不含任何糖基 Ka = 1015mol/L 1个SA可与4个B结合 SA比A在应用中灵敏度高、非特异性反应少 （2）生物素、亲和素的标记技术 生物素的标记技术 亲合素的标记技术 活化生物素结合物的制备 活化生物素可结合或偶联抗体、酶、蛋白质、多肽、激素、凝集素、糖类及DNA 、RNA等 （3）生物素-亲合素系统的应用 ABC法检测图解 * 免疫酶技术（enzyme immunoassay technique）： 就是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 酶催化反应的两种基本形式： （1）E+S＝（ES）＝ E+P （2）E+S＝（ES） + D1 ＝ E + P + D2 E：酶 S：酶作用的底物 P：底物分解后的产物（有色化合物） D1：供氢体 D2：为D1的氧化型（有色化合物） 一、原理 优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。 缺点： 标记反应较难掌握，容易引起蛋白失活。 一、原理 二、建立免疫酶技术的条件 三、免疫酶技术的类型 四、通用与放大技术 第三节 免疫酶技术 ?二、 建立免疫酶技术的条件 1．标记酶 2．酶标记结合物的制备 3．酶标检测仪 1.标记酶 ① 辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP） ② 碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP） ③ 葡萄糖氧化酶 （glucooxidase，Glu） ④ ?-D-半乳糖苷 （?-D-galactosidase，?-D-Gal） ２．免疫酶结合物的制备 免疫酶结合物包括酶标抗原与酶标抗体： 酶标记抗原的制备 酶标记抗体的制备 戊二醛法 　　即将标记酶通过具有双功能或多功能化学基团的交联剂连接到抗原或抗体分子上。 过碘酸法 将酶分子氧化产生活性基团，再与抗原或抗体分子结合，使之成为与相应靶分子具有特异性结合活性的酶标抗原或抗体。 一、原理 二、建立免疫酶技术的条件 三、免疫酶技术的类型 四、通用与放大技术 第三节 免疫酶技术 三、免疫酶技术的类型 酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent，ELISA） （1）直接标记法 （2）间接标记法 （3）夹心法 （4）抗体桥联法 （5）抗酶抗体法 （6）ELISPOT （1）直接标记法（direct labeling） direct ELISA—for Ag direct ELISA—for Ab （2）间接标记法（indirect labeling） （3）夹心法（sandwich assay） 双夹心法 （5）抗酶抗体法peroxidase-antiperoxidase，PAP PO抗PO法 一、原理 二、建立免疫酶技术的条件 三、免疫酶技术的类型 四、通用与放大技术 第三节 免疫酶技术 四、通用与放大技术 1 ．SPA通用系统 2．ABC放大系统 １ ．SPA通用系统 （1）SPA的发现 （2）SPA的理化性质 （3）SP