医学分子生物学实验技术..ppt

第一章　蛋白质的分离纯化 生命大分子物质的特点： 1、生命大分子是动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的活性物质 2、生命大分子的特殊性和复杂性 3、生命大分子都是由简单的小分子构成的物 4、具有特殊的结构和功能 5、生命大分子不稳定 (1) 前处理 (pretreatment) 分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。 动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织。 (2) 粗分级分离 (rough fractionation) 当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。 一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质(包括脱盐)，又能浓缩蛋白质溶液。 有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓缩。 (3) 细分级分离 (fine fractionation) 进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。 (4) 结晶 结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。 由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的，结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。接入晶种常能加速结晶过程。 纯化方案的设计与评价 纯化方案的设计与评价 纯化方案的设计与评价 蛋白质纯度和性质的分析 几种常用的蛋白质纯化方法： 根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法： ①分子大小； ②溶解度； ③电荷； ④吸附性质； ⑤对配体分子的生物学亲和力等。 根据分子大小不同的纯化方法 1．透析和超过滤 透析(dialysis)是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。常用的半透膜是玻璃纸和其他改型的纤维素材料。 2．密度梯度(区带)离心 蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成独立的区带， 密度梯度 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度。 蔗糖便宜，纯度高，浓溶液(60％，W／W)密度可达1.28 g／cm3。 聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1—氯—2，3—环氧丙烷合成的高聚物，Mr约400 000。 密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大，向上逐渐减小 凝胶过滤层析 (分子排阻 ) （1）凝胶过滤的介质 凝胶过滤所用的介质是凝胶颗粒，其内部是多孔的网状结构， 二、利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：①溶液的pH，②离子强度，③介电常数，④温度。 自身因素：在同一的外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度，这是因为溶解度归根结底取决于它们本身的分子结构，例如分子所带电荷的性质和数量、亲水基团与疏水基团的比例，它们在蛋白质分子表面的排列以及由此而产生的偶极矩等。 1. pH控制蛋白质的沉淀 蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。 不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。 2. 蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。 盐析：当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（salting out）。 3．有机溶剂分级分离法 与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。 3．有机溶剂分级分离的机理 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。水是高介电常数物质(20℃时，80)，有机溶剂是低介电常数物质(20℃时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促