人的外周血淋巴细胞培养.docVIP

人的外周血淋巴细胞培养 摘 要： 正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。[1] 关键词： 外周血淋巴细胞 低渗处理 空气干燥法 染色体组型分析 前 言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便。 1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使 细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染 色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈 现明显形而利于辨认。 淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。[3] 淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[2] 染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较 好的固定效果。 1.材料方法 1.1 材料 人的外周血淋巴细胞。 1.2 器具 采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、 电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪 1.3 药品 1.3.1 RPMI“1640”培养基 称取“1640”粉末 1.05 g，用 100 mL的双蒸水溶解，溶解后 pH 值调至 6.0。每1000 毫升溶液加NaHCO31.0克，校正PH到7.1。 1.3. 2 肝素 作为抗凝剂使用。称取该粉末8 mg（每mg含 126 单位）， 用 2 mL的生理盐水溶解，此溶液的浓度为 504 单位/mL。 1.3.3 生理盐水 用0.9克NaCL加入100mL蒸馏水中，配制溶液。 1.3.4 秋水仙素 作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素1mg，用25mL生理盐水溶解，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1mL注射器吸取该溶液0.1mL加入5mL的培养物中，其最终浓度为0.8微克/毫升。 1.3.5 植物凝血素（PHA） 是淋巴细胞有丝分裂刺激剂，本实验采用的是市面上购买的PHA粉末，一个针剂为0.2mL。将1瓶粉末溶在2mL的蒸馏水中。 1.3.6 抗菌素 青霉素（以每瓶 80 万单位为例）：将1瓶青霉素溶在8mL生理盐水中，则每毫升含10万单位。取0.1mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为1000单位/mL。 链霉素（以每瓶 100 万单位为例）：以4毫升生理盐水稀释，则每毫升含100万单位，取0.1mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为100单位/mL。 1.3.7 吉姆萨染液 实验室中有现成染液 1.3.8 3.5%NaHCO3溶液 实验室有已配好的试剂。 1.3.9 0.1mol/L磷酸缓冲液 实验室有已配好的试剂。 2 方法步骤 2.1 分装培养液 用移液管将培养液和其他各试剂分装入培养瓶中，每瓶量为： RPMI“1640”培养基