泛素特异性蛋白酶USP研究进展.pptx

泛素特异性蛋白酶46（ubiquitin-specificprotease46,USP46）研究进展 ;一.真核细胞内蛋白质的降解途径介绍;泛素-蛋白酶体系统;二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍; 是一个泛素分子(ubiquitin)通过其羧基端结合到目的蛋白赖氨酸(Lys,K)上的共价反应过程。泛素本身有7个赖氨酸残基位点，分别是K6、K11、K27、K29、K33、K48以及K63位，并且泛素本身的赖氨酸残基也可以再与泛素分子相互结合。 ;首先,在E1催化下泛素的羧基端与E1的半胱氨酸激活位点以硫酯键结合,此过程需要ATP; 其次,泛素被转运到E2的半胱氨酸残基,同样是以硫酯键的形式接合; 最后,在E3的作用下,泛素的羧基端与底物蛋白的赖氨酸-ε氨基基团之间形成肽键从而将泛素转移到底物蛋白上。 E3具底物特异性;二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍; 去泛素化酶在维持游离泛素和泛素结合蛋白的动态平衡中发挥着重要作用。细胞内广泛存在多种去泛素化酶，按结构不同分为5种类型。包括 泛素特异性蛋白酶（USPs） 泛素羧基末端水解酶（UCHs） Machado-Joseph disease protein domain proteases（MJDs）， 卵巢肿瘤相关蛋白酶（OTUs） MPN（+）/JAMM 蛋白酶（JAMMs） 泛素特异性蛋白酶（USPs）是去泛素化酶中成员最多，且结构最具多样性的一类。 ;二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍;3.去泛素化酶USP蛋白家族介绍 ;Multi-tissue expression of Usp46 mRNA in Rattus norvegicus ;USP46调控抑郁;Shigeru Tomida, et al. nature genetics, 2009,41(6): 688-695.;Shigeru Tomida, et al. nature genetics, 2009,41(6): 688-695.;Usp46第92号赖氨酸缺失导致酶活下调;USP46 基因标签 SNP 的单倍型与重度抑郁症相关;The deubiquitination enzyme USP46 functions as a tumor suppressor by controlling PHLPP-dependent attenuation of Akt signaling in colon cancer;三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症;293T细胞中，GST, GST-PHLPP1，GST-PHLPP2片段拉USP46，只有PHLPP蛋白的C端与USP46相互作用。;D. USP46与PHLPP相互作用的最小作用区段是C端的1139-1172，PHLPP1与PHLPP2的1139-1172区段是保守的 E. 同样，在PHLPP2中，也是这个保守区段1268-1301与USP46相互作用。 ;Fig. 2A and 2B：在HCT116细胞中，超表达WT USP46可以显著提高PHLPP的蛋白水平，其效应是减少了70%的Akt磷酸化水平。将USP46催化区段Cys突变为Ser后，突变体USP46则失去了调控PHLPP表达水平和Akt磷酸化水平能力。;在HCT116细胞中，野生型USP46可以上调PHLPP1的表达水平，而Δ1139突变体和USP46-C44S没有效应(Fig. 2C) 失去了磷酸化位点的PHLPP1-4A突变体，由于有抗泛素化降解作用而使其蛋白水平远远高于WT PHLPP1。USP46不能进一步提高PHLPP1-4A突变体的表达水平，表明USP46通过去泛素化来提高PHLPP蛋白的表达 ;USP46敲低后，PHLPP降解大大加快。 PHLPP1和PHLPP2的半衰期分别由4.6h降为2.3h，和6.1h降为3.3h (Fig. 2F and 2G)。;体外检测，经WT USP46处理后，PHLPP1的泛素化水平下降，但USP46-C44S突变体无此效应(Fig. 3A) 经MG-132(蛋白酶抑制剂) 处理后提取蛋白样品检测，发现超表达WT USP46显著下调PHLPP1的泛素化水平，而USP46-C44S突变体无此效应(Figure 3B)。 ;USP46敲低后PHLPP1的泛素化水平显著上升(Fig. 3C，3D)。;当仅超表达PHLPP1时，Akt的去磷酸化水随PHLPP1的表达增加而下调。然而，Akt的去磷酸化程度很低(Fig. 4A, lanes 1-4)。 共表达USP46和PHLPP1可以很显著地下调PHLPP1作用的Akt去磷酸化，因为USP46可以稳定PHLPP1蛋白水平(Fig. 4A,lanes 5-6)。;