实时荧光定量PCR技术.ppt

试剂的处理与保存条件 Reagent Storage Temp. Storage State Taq DNA polymerase –20oC Not Critical 10X PCR Buffer –20oC Not Critical 50 mM MgCl2 18–24oC Not Critical 100 mM dATP Solution –20oC Not Critical 内掺染料 –20oC Dark 软件设置 演示 结果分析 标准视图： 差异视图： 1. 突变发现/筛查/扫描 2. SNP 基因分型/等位基因区分 3. 物种鉴定 4. 甲基化位点的筛查/甲基化程度分析 5. 法医学鉴定、亲子鉴定。检测单核苷酸多态性SNP鉴定，插 入/缺失多态性DIP鉴定等??? HRM应用 可以区分单碱基差异 HRM基因分型不需要设计特异性的TaqMan探针，只是通过溶解曲线的分析来区分等位基因，从而大大降低了检测成本。 使用两种不同的等位基因特异性正向引物，正向引物3’ 端的最后一个碱基对应于SNP位点的两等位基因，反向引物都一样，并使用荧光染料来检测PCR产物。纯合子基因组DNA只能被与其完全匹配的正向引物扩增，而杂合子基因组DNA能同时和两种正向引物结合扩增出两种PCR产物。 HRM应用 市场部潘娜 Tel:010256 Email:panna@ 实时荧光定量PCR技术、应用及产品 实时荧光定量PCR定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 与普通PCR的区别 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。 定量PCR技术原理 荧光标记方法 SYBR Green法工作机理 -- SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光；变性时，DNA双链分开，无荧光； -- 随着双链DNA的不断扩增，会结合越来越多的荧光基团，在每个循环的延伸结束阶段采集荧光信号。 定量PCR技术原理 荧光标记法 TaqMan探针法 -- 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 -- 3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q) -- 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 -- Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 定量PCR技术原理 SYBR Green法 TaqMan法 优点 对DNA模板没有选择性 使用方便 价格便宜 对目标序列的高特异性 引物设计相对简单 重复性比较好 缺点 容易与非特异性双链DNA结合， 产生假阳性 对引物特异性要求高 只适合一个特定的目标 价格较高 定量PCR技术原理 绝对定量和相对定量 绝对定量：通过标准曲线检测起始模板数的精确拷贝数 相对定量：通过内标确定经过不同处理的样本之间基因的表达差异 HRM分析 HRM（High Resolution Melt），即“高分辨率熔解曲线”，是近几年来在国外兴起的必威体育精装版SNP及突变研究工具，是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。 HRM是基于核酸的物理性质，通过饱和的插入染料监控DNA熔解曲线变化而进行分析的一种技术。该技术仅仅只是在标准PCR试剂的基础上再加入双链DNA结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。 HRM应用主要基于两种技术的进步： 双链DNA嵌入型饱和荧光染料如LC Green 具有精确控温装置和高密度数据采集的仪器 HRM发明者Carl Wittwer博士 原始曲线 随着DNA熔解，插入DNA双链中的染料被释放，荧光信号骤降 导数图 “速率”曲线的最高峰是分离速率最大的点，即等于熔解温度 对PCR的扩增子进行加热，温度 从50℃逐渐上升到95℃。扩增子逐渐解链，到达熔解温度（Tm）时，DNA双链完全分开。 初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度下降。通过检测器，记录荧光变化的过程。对数据作图，就生成了熔解曲线 。 HRM分析过程 嵌入型染料--非饱和染料SYBR? Green I SYBR? Green I 对PCR有抑制作用，必需使用低浓度；即使是高浓度，也不能饱和插入DNA双螺旋结构中的小沟 非饱和态结合使染料在熔解过程中发生重排，染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变